Доктор биологических наук Николай РАВИН, заместитель директора по научной работе, заведующий лабораторией систем молекулярного клонирования Центра "Биоинженерия" РАН (Москва)

Разнообразные природные сообщества микроорганизмов могут включать тысячи различных видов, большинство из которых обычно не удается культивировать в лабораторных условиях, а следовательно, и охарактеризовать. Но задача оказалась разрешимой с появлением новых методов геномного анализа. Применяя их, мы исследовали состав микробных сообществ горячих источников Камчатки и месторождений гидратов метана на дне озера Байкал.

КЛЮЧ - НУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Одна из важнейших задач микробиологии, как, впрочем, и других классических биологических наук, - идентификация и классификация объектов исследования. Если, например, зоология и ботаника используют для этого все разнообразие морфологических признаков животных и растений, то для микроорганизмов такой подход не очень продуктивен, т.к. число дифференцирующих внешних особенностей у одноклеточных сравнительно невелико. Вот почему наряду с размером и формой клеток, наличием или отсутствием жгутиков и т.п. классификация микробов основана на разнообразии их функциональных характеристик - способности к росту на различных субстратах, образованию определенных продуктов метаболизма, зависимости от кислорода и т.д. Но на уровне одной клетки, являющейся целым

организмом, из-за слишком малых ее размеров изучать эти особенности невозможно. Препятствие удалось преодолеть с появлением методов культивирования, т.е. выращивания в лабораториях чистых культур идентичных клеток. Именно их анализ дал представление о разнообразии путей метаболизма и биохимических процессов, реализуемых микроорганизмами, их экологической роли в биосфере, а также позволил разработать методы идентификации и классификации микроорганизмов.

С середины XX в. в микробиологии получили развитие новые направления, основанные на представлениях о том, что все функциональные характеристики любого живого организма определяются его геномом, т.е. последовательностью нуклеотидов в ДНК. Важным результатом применения в данной области науки молекулярных методов стало создание системы идентификации и классификации, основанной на секвенировании* и сравнении нуклеотидных последовательностей генов 16S рибосомной РНК**, имею щихся у всех микроорганизмов. Степень сходства генов этой РНК отражает эволюционное родство. Учитывая это обстоятельство, американский ученый Карл Вёзе в конце 1970-х годов предложил единую филогенетическую систему прокариот (организмов, не обладающих, в отличие от эукариот, оформленным клеточным ядром). Он же установил, что археи*** образуют третий домен живых существ, наряду с бактериями и эукариотами.

В последующие годы базы данных нуклеотидных последовательностей 16S рРНК стали ускоренно пополняться по мере совершенствования технологий геномного секвенирования. Последние были применены и к метагеномной**** ДНК, выделенной из природных источников, таких как почва, морская вода, кишечник человека и др. Здесь-то и выявилась ограниченность упоминавшихся культуральных способов анализа микроорганизмов. Оказалось, большинство из них, идентифицированных в природных сообществах по последовательностям генов 16S рРНК, не имеют культивируемых родственников, представляют собой отдельные филогенетические ветви, о метаболизме представителей которых и их экологической роли ничего неизвестно. Более того, культивировать в лабораторных условиях удается, как правило, не более 0,1 - 1% микроорганизмов природных сообществ; о существовании остальных стало известно лишь благодаря использованию молекулярных способов анализа.

Напомним, в СССР работы по определению последовательностей нуклеиновых кислот были начаты в 1960-х годах практически одновременно с первыми аналогичными поисками зарубежных ученых. В 1967 г. биохимик Александр Баев определил последовательность валиновой (т.е. несущей аминокислоту валин) транспортной РНК дрожжей. Расшифровка собственно геномных последовательностей, т.е. ДНК, требовала принципиально иных подходов. Методы секвенирования этой сложнейшей биомолекулы были разработаны в лабораториях американ-

* Секвенирование - определение последовательности нуклеотидов в цепочке ДНК (прим. авт.).

** Рибосомная РНК (рРНК) - несколько молекул рибонуклеиновой кислоты, составляющих основу рибосомы, на которой происходит синтез белка (прим. ред.).

*** Археи - одноклеточные прокариоты, на молекулярном уровне заметно отличающиеся как от бактерий, так и эукариот. Особенности проявляются в компонентах синтеза белка, структуре клеточной стенки, биохимии, устойчивости к факторам внешней среды, например, высокой температуре (прим. ред.).

**** Метагеномная ДНК - суммарная ДНК всех микроорганизмов, входящих в состав исследуемого сообщества (прим. авт.).

Состав микробного сообщества "Источника Заварзина". График (a) показывает зависимость числа идентифицированных видов бактерий от числа анализируемых последовательностей генов 16S pPHK. На диаграмме (b) показаны доли основных групп микроорганизмов сообщества.

ского биофизика Уолтера Гилберта (нобелевский лауреат 1980 г.) и английского биохимика Фредерика Сенгера (нобелевский лауреат 1958 и 1980 гг.). В конце 1970-х годов для полной расшифровки оперона* генов рибосомных РНК дрожжей их применил ученик академика Баева Константин Скрябин.

Определение последовательности нуклеотидов в цепочке ДНК открыло возможность идентификации белков, кодируемых соответствующими генами. Первая такая работа в нашей стране - речь идет о фрагментах генома бактериофага лямбда - была опубликована в 1979 г. коллективом ученых: Юрием Овчинниковым, Константином Скрябиным, Евгением Свердловым и Александром Баевым. Работы по секвенированию отдельных генов человека, животных, растении и микроорганизмов, а позднее и полных геномов вирусов продолжились в 1980-х годах в нескольких институтах АН СССР. Однако исследования в области молекулярной идентификации микроорганизмов в России практически не велись до середины 1990-х годов, когда в Центре "Биоинженерия" РАН было создано соответствующее исследовательское подразделение. За прошедшие годы по последовательностям генов 16S рРНК здесь определено более тысячи бактерий и архей.

Методы геномного секвенирования на протяжении минувших 30 лет постоянно совершенствуются, в результате чего их производительность растет, а стоимость снижается. Так, качественным скачком стал метод параллельного пиросеквенирования**, предложенный американской компанией 454 Life Sciences (в настоящее время в составе фирмы Roche)

* Оперон - участок генетического материала, состоящий из двух или более генов, которые транскрибируются в составе одной РНК и являются функционально связанными, например, кодируют белки (ферменты), осуществляющие последовательные этапы биосинтеза какого-либо метаболита (прим. ред.).

** Пиросеквенирование - аналитический метод назван так, поскольку важную роль в нем играют пирофосфаты (анионы, соли и эфиры пирофосфорной кислоты) (прим. ред.).

Предполагаемая схема образования гидратов метана в донных осадках озера Байкал.

в 2005 г. - применяя его, можно одновременно определить сотни тысяч нуклеотидных последовательностей ДНК в индивидуальных реакциях, тогда как на основе традиционного капиллярного электрофореза удается единовременно анализировать не более нескольких десятков образцов.

Подчеркну: многие микробные сообщества имеют сложный состав, включающий бактерии и археи сотен видов. И используя для анализа последовательностей генов 16S рРНК метод пиросеквенирования, выявляют не только доминирующие микроорганизмы, но и минорные, т.е. присутствующие в очень малых количествах, которые, однако, могут играть важную функциональную роль. А в результате появляется возможность достоверного количественного определения отдельных групп микробов, что необходимо для реконструкции метаболических путей сообщества в целом.

В России работы по изучению микробных сообществ с использованием методов высокопроизводительного секвенирования были начаты Центром "Биоинженерия" РАН в 2008 г., т.е. почти одновременно с первыми разработками западных коллег в этой области. Что же нам удалось узнать?

В ТЕРМАЛЬНЫХ ИСТОЧНИКАХ КАМЧАТКИ

Долгое время считалось, что микроорганизмы, как и другие формы жизни, не могут развиваться при температурах выше 50 - 60°С. И важное открытие в 1970-х годах сделал американский ученый Томас Брок, обнаруживший в горячих источниках Йеллоустонского парка США микробы, растущие при температурах до 80°С. Позднее термофилы, в основном представленные археями, были выявлены в различных горячих источниках вулканического происхождения, глубоководных морских гидротермах, высокотемпературных нефтяных скважинах. Причем верхний предел температуры роста (122°С) зафиксирован для архей, обитающих в глубоководных источниках на дне океана в условиях высокого давления*.

Интерес к термофилам обусловлен их значением как для фундаментальных исследований, так и перспективами практического использования. Термофилы принадлежат к эволюционно древним группам микроорганизмов, а их сообщества можно считать аналогами экосистем, существовавших миллиарды лет назад на еще горячей Земле в бескислородной атмосфере. Пример - наноархеи, обладающие среди всех живых организмов самым минимальным по размеру геномом. Что же касается практики, то продуцируемые термофилами термостабильные ферменты найдут применение в различных областях биотехнологии, скажем, как расщепляющие жиры и белки биодобавки в составе моющих средств.

Основной объект наших поисков, проводимых совместно с коллективом доктора биологических наук Елизаветы Бонч-Осмоловской** из Института микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН (Москва), - термальные источники Камчатки. Здесь, в Долине гейзеров, кальдере вулкана Узон*** и ряде других районов, их сотни, причем с разнообразными

* См.: А. Лисицын, А. Сагалевич. Главное открытие в океане. - Наука в России, 2001, N 1 (прим. ред.).

** См.: Е. Бонч-Осмоловская. Термофилы: прошлое планеты, будущее биотехнологии. - Наука в России, 2010, N 4 (прим. ред.).

*** См.: В. Мосолов. Кроноцкие уникумы. - Наука в России, 2011, N 2 (прим. ред.).

физико-химическими характеристиками - температурой, кислотностью, химическим составом воды, присутствием газов вулканического происхождения.

Так, мы проанализировали микробные сообщества пяти термальных источников кальдеры вулкана Узон, различающихся двумя наиболее важными для роста микроорганизмов параметрами, - температурой и кислотностью воды. Один из них - "Источник Заварзина" - представляет собой мелкий бассейн размером 4,5 х 2,3 м. В менее горячих его участках, расположенных по краям, дно покрыто матом из цианобактерий толщиной несколько миллиметров. Температура воды умеренно высокая (58°С), показатель ее кислотности нейтрален (pH 6,3), высоко содержание взвешенной серы. Другой источник -"Бурлящий" - самый горячий на Узоне, температура воды в нем достигает точки кипения (90 - 94°С) с учетом высоты над уровнем моря, pH также нейтрален (6,7). Три других - "1884", "1805" и "1810" - имеют высокую кислотность (pH 3,7 - 4,1), но различаются по температуре воды (соответственно 50, 60 и 90°С).

Наибольшим биоразнообразием отличается "Источник Заварзина" - в нем обнаружено свыше ста видов бактерий, составляющих около 95% всех обитающих здесь микроорганизмов, на долю архей приходится лишь порядка 5%. К тому же одна из филогенетических ветвей бактерий оказалась новой эволюционно древней группой, представители которой зафиксированы только в данном источнике. Полноценная характеристика микробного сообщества стала возможной лишь благодаря применению пиросеквенирования (проанализированы около 35 тыс. последовательностей 16S рРНК); традиционные методы не могли бы выявить и одной десятой обнаруженного разнообразия. Причем полученные нами новые данные позволяют выдвинуть гипотезу о природе экологических взаимосвязей между основными группами микроорганизмов этого источника.

Оказывается, первичное продуцирование органики может осуществляться как фотосинтезирующими цианобактериями, так и различными группами хемолитоавтотрофов, окисляющих восстановленные вещества вулканического происхождения (водород, сера и др.), поставляемых геотермальным потоком. Всю эту и поступающую с поверхностными водами из окружающих районов органику используют разнообразные органотрофные микроорганизмы, в число которых входят бактерии как сбраживающие органические субстраты, так и полностью их окисляющие за счет использования в качестве акцептора электронов кислорода, серы или нитрата. Большое количество филогенетически разнообразных групп, из которых ни одна не доминирует, свидетельствует: это хорошо сбалансированное сложное сообщество, где каждая группа занимает свою экологическую нишу. Такое сообщество можно рассматривать как модель первичных экосистем древней Земли.

Совершенно другое "население" обнаружено нами в высокотемпературном источнике "Бурлящий". Оно фактически включает всего две группы микроорганизмов - бактерии типа Aquificae и археи порядка Thermoproteales. Обе относятся к хемолитоавтотрофам, синтезирующим органику из CO₂, используя при этом энергию молекулярного водорода и других восстановленных веществ вулканического происхождения. Вероятно, такая простая структура сообщества определяется ограниченностью спектра доступных субстратов и "отбором" микробов, растущих при экстремально высокой температуре.

В отличие от термальных источников с нейтральным pH воды, кислые изучены мало, поэтому неудивительно, что нас ожидал ряд сюрпризов при ана-

лизе упомянутых "1884", "1805" и "1810". Прежде всего отметим: большинство микроорганизмов в них составляли не бактерии, а археи, лучше приспособленные к выживанию при высокой температуре и кислотности. Причем наибольшее микробное разнообразие обнаружено в "прохладном" (50°С) источнике "1884". Одной из наиболее многочисленных групп бактерий оказались представители рода Acidithiobacillus, аэробно окисляющие железо и серу. Окисление серы приводит к образованию серной кислоты, таким образом именно активность Acidithiobacillus может быть причиной высокой кислотности среды. Бактерии еще одной группы, Verrucomicrobia, способны окислять газ метан, поступающий с геотермальным потоком. Для их роста требуются умеренно высокая температура и кислая среда, как раз создаваемая Acidithiobacillus.

Наиболее неожиданный результат был получен при анализе "архейной" компоненты сообщества. Оказалось, что более 90% обнаруженных архей представляли филогенетические линии, в которых вообще нет микроорганизмов, культивируемых известными методами классической микробиологии. Их метаболизм и экологическая роль требуют дальнейшего изучения.

В высокотемпературных кислых источниках "1805" и "1810" около половины архей составляли представители порядка Sulfolobales, встречающиеся в сульфатарах* и кислых гидротермах по всему миру. Эти археи окисляют серу, водород и органические соединения, именно их деятельность может вызывать высокую кислотность источников. Наиболее интересным и еще одним неожиданным результатом стало обнаружение здесь наноархей, причем их доля выше всего в экстремальнейших условиях источника "1810" (90°С, pH 4,1). Как уже говорилось, они представляют собой эволюционно древнюю ветвь. Единственная культивируемая из них, Nanoarchaeum equitans, обнаруженная в свое время в глубоководной морской гидротерме, - симбионт другой археи, Ignicoccus hospitalis. Отсутствие в этом источнике ее родственников и большая доля наноархей (24% всех архей) позволяют предположить, что они могут являться свободноживушими организмами - реликтами древних экосистем.

НА ДНЕ ОЗЕРА БАЙКАЛ

Другой объект наших работ - микробные сообщества, обнаруженные в месторождениях гидратов метана. Но прежде чем рассказать о них, небольшое отступление. Гидраты метана - перспективный топливно-энергетический ресурс, их разработка станет возможной в ближайшей перспективе. Они представляют собой твердые кристаллические соединения воды с газами, образующиеся в условиях высокого давления и низких температур. Величина их запасов как минимум в несколько раз превосходит ресурсы традиционного газа. Основные места залегания обнаружены в осадках на дне морей и океанов, в районах вечной мерзлоты, большие объемы имеются и на арктическом шельфе России.

Интерес к таким залежам обусловлен не только перспективами их использования как энергоносителей, но и потенциальным влиянием на глобальные изменения климата. Дело в том, что повышение температуры Земли приводит к нарушению стабильности гидратов и эмиссии газообразного метана. А рост в атмосфере концентрации метана, одного из активных парниковых газов, в свою очередь увеличивает парниковый эффект и ведет в дальнейшему повышению температуры.

В настоящее время обсуждаются различные гипотезы происхождения гидратов метана, предполагающие как их биогенные (синтез микроорганизмами), так и абиогенные (термическая деградация углеводородов) источники. Исследования морских гидратов метана показали их взаимосвязь с сообществами различных микроорганизмов как образующих, так и окисляющих метан. Но хорошо известно, что вслед-

* Сульфатары - заполненные водой воронки, нагреваемые выходами горячего водяного пара с примесями сероводорода, углекислого и других вулканических газов (прим. авт.).

ствие различий в минеральном составе воды морские и пресноводные микробные сообщества, а также осуществляемые ими биогеохимические процессы, существенно различаются.

Единственный в мире пресный водоем, на дне которого обнаружены области залегания газовых гидратов, - озеро Байкал. Образование их в осадках на дне возможно благодаря большой глубине озера (до 1642 м), обеспечивающей высокое давление, и низкой температуре воды (3 - 4°С).

Целью работы, выполненной нами в сотрудничестве с коллективом доктора биологических наук Тамары Земской из Лимнологического института СО РАН (г. Иркутск), являлся анализ состава микробных сообществ, ассоциированных с газовыми гидратами озера Байкал, и идентификация различных групп микроорганизмов, ответственных за образование и окисление метана. Для проведения анализа из находящегося на глубине около 1400 м района залегания гидратов метана были отобраны пробы придонной воды и две пробы осадков - приповерхностного (до 1 см) и глубинного слоя (85 - 90 см), непосредственно прилегающего к гидрату. Пробы придонной воды были отобраны с глубоководного аппарата "Мир" в ходе экспедиции 2009 г.

Состав микробных сообществ был проанализирован с помощью пиросеквенирования генов 16S рРНК. В придонной воде выявлено около пятисот видов микроорганизмов, 99% из них составляли бактерии и лишь 1% - археи. Около половины бактерий относились к обычным "водным" видам, характерным для пресных водоемов, а вторую половину составляли метанотрофные, семейства Methylococcacea, представители которого растут, окисляя метан растворенным в воде кислородом. Отметим, из всех 29 тыс. идентифицированных в Байкале по последовательностям 16S рРН К бактерий ни одна не относится к известным патогенным видам, что свидетельствует о чистоте воды и ее безопасности для человека.

В отличие от воды в донных осадках озера значительную долю микроорганизмов составляли археи - около двух третей в приповерхностном слое и порядка 30% в глубинном. В первом обнаружены разнообразные органотрофные бактерии и археи, разлагающие накапливающуюся в виде донных осадков органику, - отмершие водоросли, цианобактерии и т.п. Осадки служат анаэробной (бескислородной) экологической нишей, в которой органические вещества сбраживаются органотрофами с образованием ацетата и водорода в качестве основных продуктов. Эти вещества могут использоваться в качестве субстратов метаногенами* - наиболее многочисленной группой архей, обнаруженных нами там же. Поскольку вода Байкала обладает низкой минерализацией, то именно метаногенез является конечной стадией разложения осаждающейся из водной толщи органики. Образовавшийся газ либо "захоранивается" в виде гидратов, либо поднимается вверх, где эффективно окисляется в придонной воде аэробными метанотрофными бактериями. Таким образом, экосистема озера обеспечивает образование гидратов метана и предотвращает эмиссию этого парникового газа в атмосферу.

Что касается микробного сообщества глубинного слоя осадков, то оно включает различные группы бактерий и архей. Свыше 90% из них относятся к разным филогенетическим линиям, не имеющим культивируемых представителей. Микроорганизмы "глубинной" биосферы, как и их метаболизм, в настоящее время остаются практически неизученными.

В заключение хотелось бы отметить, что благодаря применению современных молекулярных методов в сочетании с классическими микробиологическими и биохимическими подходами, потенциал отечественной микробиологии в последние годы существенно вырос. Во многом это стало возможным благодаря проектам Министерства образования и науки РФ, РФФИ и программам фундаментальных исследований РАН. Так, если до 2007 г. в России не было расшифровано ни одного полного генома микроорганизма, то за последние несколько лет их прочтено уже почти два десятка, причем нашим коллективом в Центре "Биоинженерия" РАН определено около 10% всех известных полных геномов архей.

Разумеется, диапазон возможностей высокопроизводительного секвенирования далеко не исчерпывается определением таксономического состава сообществ. Ведь филогенетическая близость не всегда коррелирует со сходством путей метаболизма микроорганизмов. Поэтому для максимально достоверной реконструкции последнего необходимо не только установить состав сообщества, но и "прочесть" весь массив генетической информации, т.е. определить нуклеотидные последовательности всего "метагенома", а затем идентифицировать гены и проанализировать их возможные функции. Решение этой задачи до последнего времени могло быть реализовано лишь в немногих крупных научных центрах и требовало больших финансовых затрат. Разработка новых технологий геномного секвенирования, сопровождающаяся повышением производительности и снижением стоимости, расширяет возможности проведения таких исследований.

Работы поддержаны Минобрнауки РФ (контракты П1049 и 02.740.11.0765) и грантами РФФИ 08 - 04 - 01273 и 11 - 04 - 00671.

* Метаногены - микроорганизмы, образующие метан; относятся к археям (прим. авт.).

Публикатор:

Постоянная ссылка для научных работ (для цитирования):

Комментарии: