Доктор биологических наук Сергей ЩЕЛКУНОВ, заведующий отделом геномных исследований Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" (поселок Кольцово, Новосибирская область)

Уже 10 лет в ряде стран мира активно развивается новая область биотехнологических исследований: создание вакцин на основе генетически модифицированных растений со встроенными фрагментами ДНК патогенных микроорганизмов. Такие трансгенные томаты, морковь, кукуруза, картофель и другие культуры найдут широкое применение в профилактической медицине. Работы в этом направлении ведут и отечественные ученые.

Схема переноса Т-ДНК в геном растения с помощью Agrobacterium tumefaciens. a-g - гены вирулентности; LBnRB- левая и правая границы Т-ДНК. Растительные ткани в месте повреждения секретируют необычные фенольные соединения (в частности, ацетосирингон - обозначен как кольцо с группой Ас), которые обеспечивают продвижение агробактерии к раневой области и индуцируют экспрессию генов вирулентности плазмиды Ti.

МУКОЗАЛЬНАЯ ИММУНИЗАЦИЯ

Вакцинация - наиболее эффективный и экономичный способ защиты от инфекционных заболеваний, особенно вирусных, поскольку лекарственных препаратов для лечения ряда из них практически нет. Ранее из патогенных микроорганизмов вакцины получали методом проб и ошибок, но с развитием молекулярной биологии и генетической инженерии в последние годы появились более совершенные технологии их создания. Новинки этого ряда должны быть безопасными, недорогими, простыми по способу введения, храниться и транспортироваться без использования холодильного оборудования, что существенно для небогатых стран с жарким климатом. Таким требованиям вполне удовлетворяют съедобные растительные вакцины, в том числе разрабатываемые в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии "Вектор" в сотрудничестве с научными учреждениями СО РАН. Но прежде чем рассказать о них - экскурс в иммунологию.

Большинство инфекционных агентов проникают в организм через слизистые оболочки пищеварительной, дыхательной и мочеполовой систем человека (общая их поверхность - более 400 м, тогда как кожа - лишь около 2 м), поэтому так важны защитные функции слизистых, служащих первым оборонительным барьером на пути вторжения патогенов. Эту роль обеспечивают многочисленные иммуно-компетентные клетки, организованные в так называемую мукозальную иммунную систему. По функциям она отличается от той, что реализует защиту внутренних органов, иными словами, обеспечивает системный ответ. Многочисленные исследования показали: вакцинация с помощью инъекций эффективно предотвращает развитие инфекционного процесса в этих органах, однако не защищает слизистые оболочки. А вот мукозальная иммунизация (доставка антигена на такие поверхности) успешно решает обе задачи.

Интересен факт взаимосвязи иммунного ответа слизистых оболочек желудочно-кишечного, респираторного и генитального трактов. Так, если стимулировать его в первом, то специфичная реакция против антигена в виде продукции соответствующего секреторного иммуноглобулина* будет наблюдаться и во втором, и в третьем.

Словом, для эффективной защиты слизистых оболочек необходима мукозальная иммунизация. В ряду ее преимуществ - повышенная эффективность, упрощенное введение препарата, снижение риска заражения другими микроорганизмами по сравнению с инъекционными или иными методами, нарушающими кожные покровы (например, в случае прививки от оспы).

Правда, чтобы эти достоинства реализовать на практике, необходимо учитывать следующее обстоятельство. Интересующие нас оболочки обладают защитными физиологическими механизмами удаления любых антигенов с собственных поверхностей, в том числе при участии ферментов. Как же в таком случае преодолеть естественный барьер и благополучно доставить иммунизирующий компонент к месту назначения? Традиционно для этого используют упаковку - биодеградируемые полимерные или липидные частицы, которые чаще всего вводят через рот или нос. Другой, более современный подход состоит в получении упомянутых выше трансгенных растений, продуцирующих протективные антигенные белки инфекционных агентов, и использование их в качестве съедобных вакцин.

* Иммуноглобулины - глобулярные белки плазмы (сыворотки) крови, обладающие активностью антител, т.е. способностью специфически связываться с антигенами, подавляя их активность (прим. ред.).

Трансгенные растения томата, трансформированные векторной плазмидой pBINPLUS/ARS или гибридной плазмидой с трансгеном pBINp35S/TBI-HBS.

В чем преимущества данного подхода? В том, что стенки клеток растений обеспечивают эффективную защиту находящегося в них антигена после его попадания в ротовую полость человека, проглатывания и последующего прохождения через желудок. "Упакованный" таким образом антиген в целости и сохранности достигает кишечника, где и представляется мукозальной иммунной системе.

Важная особенность съедобных вакцин - их потенциальная низкая стоимость. По оценкам, такие рекомбинантные белки заметно дешевле аналогов, произведенных в других генно-инженерных системах (даже с применением бактерий или дрожжей), ибо не требуют специального выделения и очистки. Другие привлекательные свойства - биологическая безопасность (в них нет вирусных и других патогенов человека и животных), простота хранения и применения. Более того, можно создавать растения, одновременно продуцирующие несколько протективных антигенов различных патогенов, что на практике означает появление мультивалентных съедобных вакцин.

ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ

Растения имеют очень важное преимущество перед животными как предмет интереса специалистов в области экспериментальной биологии. Из недифференцированных соматических тканей, выделенных из единичных клеток растений, вполне реальна регенерация с образованием полноценных фертильных (способных завязывать семена) экземпляров. Это свойство - тотипотентность - открывает для молекулярных биологов большие возможности в разработке генетически модифицированных образцов.

Напомню: ключевую роль в развитии генетической инженерии растений сыграло изучение природных механизмов переноса специфичных фрагментов плазмидной ДНК (Т-ДНК) из почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens в ядро растительной клетки с последующей их интеграцией в хромосомную ДНК. Выяснение основных закономерностей этого процесса американскими и голландскими учеными в 1980-х годах позволило создать относительно простую и надежную систему введения чужеродных генов в клетки с последующей селекцией растений, содержащих целевой трансген и названных поэтому трансгенными*.

В природе агробактериальный инфекционный процесс начинается в месте повреждения растения и ведет к образованию опухолевых разрастаний тканей - корончатых галлов. Их клетки напоминают раковые у животных. Они способны к неограниченному, нерегулируемому росту, при культивировании in vitro происходящему даже в отсутствие специальных гормонов (нормальные растительные клетки такой способностью не обладают). Изучая природу индуктора опухолей A. tumefaciens, бельгийский исследователь Иво Зенен в 1974 г. выявил, что соответствующим агентом у этой бактерии является плазмида** Ti (tumor inducing) - ее размер обычно составляет 200 - 250 тыс. пар нуклеотидов.

Позднее Мэри Чилтон (США) с соавторами обнаружили: Ti содержит Т-ДНК, а она, прежде всего за счет активности примерно 35 расположенных на плазмиде генов вирулентности (патогенности), способна "выщепляться" из ее состава и передаваться в растительную клетку с последующей встройкой в хромосому ядра. Причем Т-ДНК с обеих сторон ограничена прямыми повторами длиной 25 нуклеотидных пар, называемыми правой и левой границами (RB и LB).

Т-ДНК кодирует ферменты синтеза фитогормонов (в результате чего и происходит опухолевое разрастание трансформированных тканей растения), а так-

* См.: А. Куликов, В. Митрофанов. Трансгенные организмы: как уменьшить риски? - Наука в России, 2008, N 2 (прим. ред.).

** Плазмиды - молекулы ДНК, способные к автономному размножению; широко используются в генетической инженерии как перносчики генетического материала (прим. ред.).

Плоды трансгенных растений томата, содержащие ген TBI-HBS, полученные сибирскими специалистами.

Корнеплоды трансгенных растений моркови со встройкой гена поверхностного белка вируса гепатита В, подготовленные к эксперименту по кормлению мышей.

же необычных аминокислот и Сахаров - опинов. Штаммы агробактерий, вызывающие опухоли, способны к избирательному катаболизму (ферментативному процессу расщепления) опинов, синтез которых они индуцируют. Гены ферментов биосинтеза гормонов и опинов, кодируемых Т-ДНК, хотя и находятся в самой бактерии, эволюционно адаптированы для экспрессии только в растительных клетках. Словом, A. tumifaciens является своеобразным природным генным инженером.

Важная ее особенность заключена в том, что последовательность нуклеотидов, находящихся между RB и LB, не влияет на эффективность переноса Т-ДНК из агробактерий в клетку растения. Вот почему она может послужить инструментом для переноса чужеродных генов из A. tumefaciens в геном растительных клеток.

ПРОДУЦИРОВАНИЕ ИММУНОГЕННЫХ БЕЛКОВ

В Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии "Вектор"* в содружестве с Сибирским институтом физиологии и биохимии растений СО РАН (Иркутск) и Институтом химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск) поставили перед собой задачу разработать первую в России кандидатную** съедобную растительную вакцину. При этом мы с коллегами опирались на работы зарубежных предшественников.

Концепцию такого производства впервые сформулировал в 1992 г. Хью Мэйсон с соавторами (США). Они стремились получить препарат против вируса гепатита В на основе трансгенного табака. Создав растения, продуцирующие поверхностный антиген HBsAg этого вируса, и проведя инъекционную иммунизацию мышей очищенным рекомбинантным белком, в 1995 г. ученые показали: синтезированный в растениях вирусный белок стимулирует специфичный иммунный ответ.

В том же 1995 г. Чарльз Арнтзен с соавторами (США) получили новый вариант растений трансгенного картофеля. Уже после четырех кормлений подопытных мышей его сырыми клубнями начинали вырабатываться специфичные антитела в сыворотке крови и слизистой кишечника. Так впервые была показана принципиальная возможность создания съедобных растительных вакцин. А спустя три года аналогичные клубни апробировали на небольшой

* См.: Н. Красников. Научный "вектор" Сибири. - Наука в России, 2001, N 3 (прим. ред.).

** Кандидатной называют вакцину, прошедшую доклинические испытания (прим. ред.).

группе добровольцев и обнаружили появление в крови людей специфичных антителопродуцирующих клеток.

Позднее группа американского биолога Стефена Стретфилда получила трансгенные растения кукурузы, зерна которой вызывали сильный иммунный ответ у подопытных мышей. Заметим: указанная культура - привлекательный объект для конструирования съедобных вакцин, ибо обеспечивает длительную сохранность зерна и рекомбинантного антигена в его составе без использования холодильного оборудования.

Важное направление данных исследований - создание вакцин на основе растений, которые могут широко использоваться в пищу без термообработки. Сотрудники нашего центра с коллегами из Сибирского института физиологии и биохимии растений и Института химической биологии и фундаментальной медицины решили получить препарат одновременно против вируса гепатита В и иммунодефицита человека на основе трансгенных растений томата. Проект финансировало Министерство сельского хозяйства США в рамках программы Международного научно-технического центра*.

Вирусы иммунодефицита человека (ВИЧ) и гепатита В - опаснейшие возбудители социально значимых, имеющих эпидемический характер инфекционных заболеваний. По данным Всемирной организации здравоохранения, от ВИЧ/СПИДа в мире ежегодно умирает 2 - 3 млн. человек. Количество хронических носителей вируса гепатита В на планете составляет около 350 млн, а смертность, обусловленная им, достигает 1 млн. человек в год. Во многих лабораториях мира идет интенсивный поиск средств предупреждения указанных патологий. В частности, многообещающ подход к конструированию синтетических вакцин в виде белков с оптимальным составом антигенных детерминант (фрагментов белков) соответствующих агентов. Для проверки этой концепции сотрудник "Вектора", кандидат биологических наук Алексей Ерошкин с коллегами рассчитали искусственный полиэпитопный белок, состоящий из набора иммуногенных детерминант белков Env и Gag ВИЧ-1 и названный TBI (T- and B-cellular immunogen). Эксперименты на мышах показали: последний индуцирует иммунный ответ против ВИЧ. Учитывая это, мы предложили создать растения томата, синтезирующие химерный белок, состоящий из последовательностей TBI и уже упоминавшегося поверхностного белка оболочки (HBsAg) вируса гепатита В, а затем изучить иммуно-генные свойства трансгенных плодов при скармливании их лабораторным животным.

В эксперименте мышей кормили пастой из этих томатов. Позднее провели иммуноферментный анализ сыворотки крови и фекалий иммунизированных животных на наличие антител к вирусам гепатита В и ВИЧ-1. Было показано: полученные трансгенные растения продуцируют белок, обеспечивающий при кормлении мукозальный и гуморальный иммунные ответы против указанных вирусов, и могут рассматриваться в качестве кандидатной съедобной вакцины одновременно против двух указанных инфекций.

А совместно со специалистами Института цитологии и генетики СО РАН** (Новосибирск) нам удалось получить растения трансгенной моркови, продуцирующей HBsAg вируса гепатита В, и при кормлении лабораторных мышей ее сырыми корнеплодами выявить развитие специфичного иммунного ответа против данного вируса.

Работы по созданию съедобных вакцин в последние несколько лет интенсивно развиваются, в них вовлекается все большее число лабораторий в разных странах мира. Несомненно, эти новые препараты в недалеком будущем найдут свое место в общей системе защиты от патогенов. В частности, их можно будет использовать для ревакцинации людей или животных, ранее привитых классическим способом, что повысит общий уровень иммунной защиты от инфекционных заболеваний.

* Международный научно-технический центр - межправительственная некоммерческая организация, созданная в 1994 г. на основе соглашения межу Евросоюзом, Россией, США и Японией. Секретариат расположен в Москве (прим. ред.).

** См.: В. Шумный. Приоритеты биологии. - Наука в России, 2007, N 5, (прим. ред.).

Публикатор:

Постоянная ссылка для научных работ (для цитирования):

Комментарии: