Доктор химических наук Аркадий СИНИЦЫН, заведующий лабораторией физико-химической трансформации полимеров химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова и лабораторией биотехнологии ферментов Института биохимии им. А. Н. Баха РАН

Невозможно представить современный мир без продукции биотехнологии и очевидно, что развитие этого научного направления в нашей стране, создание соответствующей производственной базы - важные условия конкурентоспособности российских товаров на внутреннем и международном рынках. Однако пока немногие перспективные разработки отечественных специалистов востребованы практикой. О некоторых обнадеживающих начинаниях нашему корреспонденту Евгении Сидоровой рассказал доктор химических наук Аркадий Синицын.

- Аркадий Пантелеймонович, вы с коллегами занимаетесь поиском новых эффективных ферментов (или энзимов), применяемых в качестве катализаторов химических реакции во многих хозяйственных отраслях. Научные публикации ваших аспирантов и сотрудников свидетельствуют о наращивании инновационного потенциала лабораторий. Расскажите, пожалуйста, как вам удается с завидным постоянством расширять список ваших разработок, несмотря на то, что в последнее десятилетие изменились и условия финансирования исследований, и ритм их проведения?

Трехмерные структуры ферментов, используемых для деструкции целлюлозы и гемицеллюлоз.

- Прежде всего отмечу уникальность нашего коллектива, включающего не только специалистов руководимых мною лабораторий, но и коллег из Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН (г. Пущино) и Научно-исследовательского института пищевой биотехнологии РАСХН. Формально нас объединяет Центр коллективного пользования, созданный в 2006 г. на базе Института биохимии им. А. Н. Баха РАН и оснащенный необходимой техникой для микробного синтеза и исследований ферментов. Но каждая группа отвечает за свою часть научных разработок. Например, коллеги из Пущино - за мутагенез* и оптимизацию ферментационных процессов, Институт биохимии - за генную инженерию, наша университетская лаборатория - за энзимологию, а все вместе ищем пути для практического применения ферментов на производстве.

Есть два пути изменения свойств и продуктивности микроорганизмов: классический - мутагенез, вызванный химическим либо радиационным воздействием, и генная инженерия. В первом направлении мы сейчас работаем со специалистами Национального исследовательского центра "Курчатовский институт". Однако трудно предсказать, как на тот или иной объект повлияет радиация. После облучения приходится анализировать активность сотен и тысяч клонов**, прежде чем удается выбрать из них высокоактивный мутантный штамм. А генная инженерия обеспечивает кратчайший путь.

В данном случае мы готовим штамм микроорганизма-хозяина, которому затем будут приданы желаемые свойства, а также векторную систему для клонирования генов - молекулу ДНК, выступающую в роли носителя некой наследственной информации. Одновременно у другого микроорганизма, специально подобранного для конкретной цели (например, речь идет о получении целлюлазы***), находим ген, отвечающий за выработку интересующего нас фермента, клонируем и осуществляем его экспрессию в упомянутом "хозяине" (при этом у последнего проявляется специфи-

* Мутагенез - внесение изменении (мутации) в нуклеотидную последовательность ДНК (прим. ред.).

** Клон - искусственно созданный организм, генетически идентичный исходному (прим. ред.).

*** Целлюлазы - ферменты гликозил-гидролазы, расщепляющие целлюлозу до олигосахаридов и глюкозы (прим. авт.).

ческий признак). Есть также методы и для того, чтобы заставить заговорить "молчаливые" гены, уже имеющиеся у хозяина. В обоих случаях получаются стабильные продуценты искомых ферментов.

Микроорганизм-хозяин устроен таким образом, что он может секретировать много белка. Таковы, например, подобранные нами штаммы мицелиальных грибов из рода Penicillium: они исключительно активны, а продуцируемые ими целлюлолитические ферменты в единицу времени перерабатывают больше целлюлозы, чем известные аналоги.

- За рубежом используют другие продуценты целлюлолитических ферментов?

Зарубежные компании в тех же целях применяют штаммы гифомицетов (несовершенных грибов) из рода Trichoderma и высших плесневых грибов из рода Aspergillus. А мы, найдя своих "чемпионов" в ходе работы по проекту Министерства образования и науки РФ 2005 - 2006 гг.*, запатентовали это открытие и продолжаем заниматься пенициллами, совершенствуя их возможности для прикладных задач.

Конечно, сегодня научный поиск ведется в условиях дефицита времени. Но мы способны выдержать этот ритм, так как располагаем многолетним банком данных о различных штаммах микроорганизмов, а также о свойствах их ферментов. Для его пополнения всякий раз, когда коллеги находят или получают новый активный микроорганизм-продуцент, мы занимаемся фундаментальными исследованиями: выделяем из культуральной жидкости все секретируемые им ферменты, смотрим, в каких количествах они выработаны, изучаем их природу, специфичность, механизм действия, структуру, думаем, для чего их можно применить.

- В какой мере результаты ваших исследований востребованы практикой?

- Сейчас в нашем "портфеле" 50 разработок. Практическое применение нашли пока единицы. Причины тому разные - порой недостаточная активность штаммов, не позволяющая им конкурировать с аналогами, существующими на мировом рынке, но в большинстве случаев - отсутствие партнеров в лице отечественных биохимических предприятий. Ферментный завод в России сейчас, по существу, только один - Производственное объединение "Сиббиофарм" в г. Бердск Новосибирской области.

Между тем, когда получен микроорганизм, чьи свойства отвечают поставленным требованиям, его надо вырастить ради вырабатываемого им фермента. И оптимизацией этого процесса на лабораторном уровне занимаются, как я уже говорил, наши коллеги из Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. ПК. Скрябина РАН и Института пищевой биотехнологии РАСХН. Им следует выполнить ряд условий: продуцент должен быть высокоактивным, давать десятки граммов фермента на литр культуральной жидкости, причем важны и оптимальные условия его культивации - например, дешевые компоненты среды, содержащей углерод, азот, фосфор.

По истечении времени, установленного для образования достаточного количества биомассы микроорганизма и завершения синтеза ферментов, культуральную жидкость, содержащую внеклеточные энзи-

* См.: А. Синицын. Универсальные ферменты. - Наука в России, 2007, N 4 (прим. ред.).

мы, извлекают из ферментера, отделяют от прочих компонентов, очищают, скажем, с помощью ультрафильтрации и подбирают стабилизаторы во избежание "атаки" различной микрофлоры при продолжительном хранении. Так получают конечный продукт - ферментные препараты. При высокой продуктивности культивируемого микроорганизма можно подойти к их промышленному производству в жидкой, сухой или гранулированной форме.

- Реально ли в настоящее время полноценно загрузить производственные мощности ферментного завода, используя потенциал исключительно отечественных разработок?

- Если объединение "Сиббиофарм" производит всего несколько ферментных препаратов, традиционных еще для индустрии СССР (целлюлаза, пектиназа, протеаза, амилаза), то сегодня мы могли бы предложить намного больше наименований, причем ферментов дешевых и потребляемых в значительном количестве (например, при получении биотоплива). Однако заметим: для реализации таких продуктов сейчас важно не только их качество, но и умение продавать, ибо российский рынок заполнен зарубежными аналогами.

- Намечен ли путь для преодоления этого кризиса в программе возрождения биотехнологической отрасли "БиоТех-2030"?

- Технологическая платформа "Биоиндустрия и биоресурсы - БиоТех2030*", сопредседателями которой являются заведующий кафедрой биоинженерии биологического факультета МГУ, академик Михаил Кирпичников и генеральный директор ОАО "РТ-Биотехпром" (входящего в состав госкорпорации "Ростехнологии") Петр Каныгин, прежде всего консолидирует отечественных биотехнологов, продолжающих работать в России. В числе "прародителей" этой программы - и директор Института биохимии им. А. Н. Баха, член-корреспондент РАН Владимир Попов. Авторы документа наметили фундаментальные и практические направления развития отрасли. А финансирование конкретных шагов должно прийти от государства и бизнеса.

Примечательно, что создание в 2009 г. компании "РТ-Биотехпром" связано с "реинкарнацией" идеи организовать в России получение биотоплива из возобновляемого углеводного сырья (древесины, однолетних растений), впервые возникшей на государственном уровне в начале 1980-х годов.

Тут уместен небольшой экскурс в историю. Волны интереса к замещению нефти возобновляемым сырьем всегда коррелируют с колебаниями цен на черное золото. На моей памяти было три подобных "всплеска" (на заре 1970-х, в 1980-х и с конца первого десятилетия 2000-х годов по настоящее время). Начало моей научной работы на кафедре химической энзимологии химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова под руководством доктора химических наук (ныне профессора Гарвардского университета) Анатолия Клесова пришлось на 1980-е годы. Но тогда наш коллектив стал заниматься новой темой не потому, что нас заинтересовала прикладная часть, - увлекала научная сторона проблемы. Обычно в энзимологии используют растворимый, низкомолекулярный субстрат, а тут мы столкнулись с полимерными, да еще нерастворимыми (целлюлоза, гемицеллюлоза и другие полисахариды). И поскольку большую роль

* См.: А. Яненко. Перспективы отечественной биоиндустрии. -Наука в России, 2011, N 5 (прим. ред.).

График, характеризующий процесс разложения целлюлозы ферментами пенициллов и триходермы.

в поведении ферментов играют процессы их адсорбции, в этом нужно было досконально разобраться. К тому же выяснилось: одному энзиму не под силу осуществить глубокую деструкцию полисахаридов -требуется согласованное действие комплекса разных веществ данной группы. Отдельная задача - разрушение лигнина, увеличение реакционной способности природного целлюлозосодержащего сырья посредством его предобработки. Словом, здесь очень интересная "научная кухня".

- Накопленный в те годы опыт, вероятно, актуален и сегодня: ведь цены на нефть все время растут?

- Это так. В середине первого десятилетия 2000-х годов, на фоне новой "волны" подорожания нефти, начали строить заводы для переработки возобновляемого растительного сырья в США, вложив в исследования довольно большие деньги. Примерно в то же время один из ведущих сотрудников ГосНИИсинтезбелок, доктор биологических наук Евгений Давидов, организовавший в свое время строительство заводов по получению белка из парафинов, убедил руководство страны использовать на простаивающих биохимических предприятиях (например, на гидролизных заводах) растительное сырье для производства новых полезных продуктов, что экономически достаточно выгодно. Он ознакомил чиновников с идеей биоконверсии, и в 2007 г. представители госкорпорации "Ростехнологии" обратились к нам с предложением разработать ферментные комплексы для получения биотоплива и других продуктов из древесины.

Мы решили взяться за поставленную задачу и включились в работу по комплексному проекту, стартовавшему в 2011 г. Ведет его ОАО "РТ-Биотехпром", а финансируется он частично государством, частично из внебюджетных источников, т.е. из собственных средств "РТ-Биотехпрома". Конечная цель - построить на базе бывшего гидролизного завода по производству бутанола в г. Тулун Иркутской области пилотное предприятие ОАО "Восточно-Сибирский комбинат биотехнологий" для получения из древесины спиртов и Сахаров с помощью биотехнологических методов.

Предварительно мы попросили наших партнеров представить субстрат, с которым предстоит работать. Дело в том, что в концепции так называемой биофабрики (термин, широко употребляемый в Европе и означающий замену углеводородов на углеводы) есть один узкий момент: с точки зрения ферментативного получения Сахаров растительное сырье обладает низкой реакционной способностью. Если бы это было не так, микрофлора буквально "поела" бы все леса. Следовательно, как я отмечал, нужна предобработка исходного растительного материала - измельчение с целью разрушения кристаллической структуры, воздействие кислотой или щелочью. Методы известны давно, но их надо довести до технологии. И корпорация "Ростехнологии" и ГосНИИсинтезбелок возложили эту заботу на себя.

Ну а дальше с помощью ферментативного гидролиза можно из полисахаридов растений получить первичные "кирпичики" - глюкозу, из нее - путем сбра-

живания - этанол (реакция катализируется дрожжами) или бутанол (для этого применяют анаэробные бактерии из рода Clostridium).

- То есть бутанол можно использовать в качестве биотоплива?

- Конечно, ведь он лучше этанола по физико-химическим характеристикам: не смешивается с водой, при сгорании выделяется больше энергии. Однако производить его технически гораздо сложнее, чем этиловый спирт, а потому без государственных дотаций невыгодно. Дело в том, что упомянутые клостридии при определенной концентрации образовавшегося с их помощью бутанола сами отравляются этим веществом, и процесс приостанавливается. Тем не менее специалисты придумали, как его оптимизировать, сделать непрерывным, и в СССР работали четыре завода по производству бутилового спирта из кукурузных початков. Полученный продукт применяли для нужд химической промышленности - например, как сырье при синтезе полимеров. На комбинате в Тулуне основным сырьем станут древесные опилки, подвергнутые измельчению и кислотному гидролизу. Кстати, для биохимического предприятия не важно качество леса - годится и зараженный фитопатогенами, что чрезвычайно выгодно.

- В рамках этого нового проекта вы продолжаете работу с микроорганизмами-продуцентами целлюлолитических ферментов из вашего банка данных или подбираете новые штаммы?

- Мы продолжаем совершенствовать запатентованные нами ранее штаммы пенициллов, изучать ферментные комплексы, ими продуцируемые. И благодаря последним исследованиям начали понимать, почему ферменты этих микроорганизмов эффективнее энзимов, вырабатываемых триходермами, с которыми традиционно работают такие международные компании, как Джененкор и Даниско (ныне вошедшая в состав американского химического концерна Дюпон). Тут мы можем конкурировать с их специалистами, среди которых, кстати, есть и выпускники МГУ, в том числе воспитанники нашей лаборатории. Но и мы, и они не намерены останавливаться на достигнутом.

- Какими еще темами, помимо упомянутой, занимается ваш коллектив, наращивая "портфель будущих инноваций"?

- Мы участвуем в ряде небольших проектов. В России сегодня есть по крайней мере три отрасли, где востребованы достижения биотехнологии - целлюлозно-бумажная, пищевая и производство корма для животноводческих хозяйств. Ферменты применяют, например, для отбеливания бумаги и в начале технологической цепочки - на стадии "роспуска" целлюлозы. Причем условия среды тут очень жесткие: вы-

сокая температура, щелочные pH растворов, вводимые ферменты должны обладать экстремальными свойствами, чтобы не утратить своих качеств. Работа по их адаптации не проста. Разумеется, внедрение биотехнологических подходов изменит "лицо" производства, но вначале нужно вписаться в сложившийся здесь процесс. В этом направлении мы работаем с одним из лидеров отечественной целлюлозно-бумажной промышленности - Группой компаний "Илим" (Санкт-Петербург).

Одна из задач, которые ставят перед нами заказчики, - модифицировать целлюлозу ферментами так, чтобы ее физико-химические свойства (длина волокна, прочность, степень полимеризации) соответствовали определенным стандартам. Скажем, сейчас вошла в моду наноцеллюлоза.

- Что представляет собой наноцеллюлоза?

- Микрокристаллическую целлюлозу знают все - ее добавляют в пищу (в мороженое, например), но на самом деле никаких кристаллов тут нет, это маленькие кусочки волокна, размером 10 микрон и выше. Наноцеллюлоза также представляет собой одноразмерные иголочки, чье острие не шире 10 - 20 нм, а длина достигает 1000 нм и более. По сути дела мы имеем объект коллоидной химии. Данный материал хорош тем, что сформированный из него лист бумаги, при неизменной прочности, будет прозрачным, а если добавить его к обычной бумаге, качество последней намного возрастет.

Можно использовать эту новинку и для получения биодеградабельных материалов. Так, если подмешать наноцеллюлозу к химическому полимеру (скажем, полиэтилену), исходно не разлагаемому микрофлорой, то ее частицы легко внедрятся в исходную структуру и ускорят разложение. Впрочем, для тех же целей сейчас применяют и полилактиды, производимые на основе молочной кислоты. Тут в основе - описанная выше технологическая цепочка с ферментативной переработкой возобновляемого растительного сырья, разлагающегося до Сахаров, из которых затем синтезируют молочную кислоту. Однако полилактиды довольно дорогие, а потому их заказывают только для специальных целей.

Если же вернуться к наноцеллюлозе, то сейчас в нашей стране для ее получения сначала измельчают целлюлозу до определенных пределов, а затем применяют кислотный гидролиз. Последний процесс можно заменить ферментативным гидролизом. Но тогда нужно очень точно подобрать фермент. За рубежом уже освоили такую технологию, и отечественные производители, оценив выгоды новшества, обратились к нам с предложением о сотрудничестве. Мы проводим исследования в данном направлении.

С самого начала было понятно: речь идет не о той группе агрессивных целлюлаз (сахаролитиков), которые способны "проесть" дырку в хлопчатобумажной ткани и превратить ее целлюлозу в конечный "кирпичик" - глюкозу, а о тех ферментах, что лишь уменьшают размер частиц и волокон целлюлозы, не доводя до полного разрушения. Мы назвали такие ферменты "тополитиками" - они работают по поверхности ткани. На самом деле нам известно о них уже лет 15, со времен сотрудничества с американцами в рамках проекта по поиску энзимов, удаляющих индиго при стирке джинсов. Казалось бы, примитивная цель, но мы открыли тогда для себя много нового в области фундаментальных свойств ферментов. Действительно, целлюлазы разные, и востребованы они в разных областях. Понимая, какая из них нужна для поставленной цели, подбираешь подходящий микроорганизм-продуцент. Но, как я говорил выше, у нас правило: выделять из культуральной жидкости, независимо от узких задач, все секретируемые ферменты индивидуально, затем изучать и сведения о каждом из них включать в нашу базу данных.

- Ибо из старой базы данных можно черпать материал для решения широкого круга современных задач?

- Для этого необходимо понять молекулярную и генетическую природу интересующего нас феномена. И воздействовать на нее.

Однако первоначально требуется определенное искусство для того, чтобы в лаборатории, в очень маленьком масштабе имитировать процессы, происходящие на производстве в больших масштабах. Например, мы не можем регулярно выделять такое количество фермента, какое нужно для стирки джинсовой ткани в объеме стиральной машины. Эксперимент ставится на крошечном кусочке этой ткани, и в ходе его мы ведем скрининг ферментов, чтобы выбрать самый эффективный. На следующем этапе мы начинаем поиск: как воздействовать на свойства полученного "чемпиона", как сделать его стабильнее, активнее? Как получить высокоактивный микроорганизм, его продуцирующий?

И если 15 лет назад мы лишь строили догадки о причинах большей или меньшей эффективности разных ферментов, то теперь известно, как устроены гены, структура белка, и можно, сложив трехмерную модель, посмотреть, почему тот или иной фермент работает лучше по сравнению с аналогом, продуцируемым другим микроорганизмом.

- В эту работу вовлечены студенты кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова?

- Разумеется. И, надо сказать, среди них есть светлые головы. К счастью, в последние годы биотехнология, биохимия, энзимология, генная инженерия становятся все более привлекательными направлениями для молодежи. А мы стараемся научить их работать тщательно и вдумчиво. Ведь малейшие недоработки в эксперименте могут испортить все дело, увести исследователя в сторону с правильно намеченного пути.

В заключение хочу заметить: никогда - даже в самые тяжелые для науки времена перестройки и кризиса - мы не испытывали кадрового голода, наш коллектив всегда подпитывался талантливой (в основном, университетской) молодежью. И многие из тех, кто принял решение посвятить свою жизнь научным исследованиям, остались работать здесь.

Публикатор:

Постоянная ссылка для научных работ (для цитирования):

Комментарии: