Член-корреспондент РАН С. Г. ИНГЕ-ВЕЧТОМОВ, Л. Н. МИРОНОВА, кафедра генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета

В 2002 г. в Калифорнии состоялся III международный симпозиум "Прионы дрожжей". Четверть его участников составляли наши соотечественники (преимущественно молодые), выходцы из России и бывшего СССР, в большинстве - с кафедры генетики и селекции Санкт- Петербургского государственного университета. Сам по себе факт примечательный, поскольку если с физикой, химией и математикой дела у нас обстоят еще благополучно, то о биологии этого не скажешь. Этот форум примечателен и тем, что был посвящен новейшему направлению науки - изучению белков-носителей наследственной информации.

Современные представления о хранении и передаче наследственной, или генетической, информации лучше всего выразил англичанин, лауреат Нобелевской премии 1962 г. Ф. Крик еще в 50-е годы XX в. в виде центральной догмы молекулярной биологии. Согласно ей, гены - это дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). Она способна к самовоспроизведению и передает зашифрованную в ней информацию на молекулы мРНК (матричная рибонуклеиновая кислота), в свою очередь служащие матрицами для синтеза белков. Именно последние осуществляют все химические реакции в клетке и организме, но не служат переносчиками генетической информации. Центральная догма справедлива и сегодня, однако в последние годы появилась необходимость слегка ее отредактировать. Оказалось, некоторые белки все же переносят наследственную информацию, правда, не посредством репликации (самовоспроизведением), как делают нуклеиновые кислоты, а благодаря конформационной перестройке уже синтезированных молекул.

Вклад наших ученых в разработку этой области биологии признан мировым научным сообществом. А смешанные чувства возникают в связи с тем, что многие выпускники нашей кафедры генетики, в том числе и определяющие "погоду" в этой области, работают не в России, а за рубежом, как правило, в США.

Все началось с того, что американцы Д. К. Гайдушек - врач, вирусолог, биохимик, этнограф, нобелевский лауреат 1976 г. - и Б. С. Бламберг в 50-е годы раскрыли причину смертельного инфекционного заболевания куру, распространенного в племени форе на Новой Гвинее, где было зарегистрировано около 2,5 тыс. пораженных этой болезнью (примерно 1% от общей

стр. 62

Центральная догма молекулярной биологии в формулировке Ф. Крика (А) и в современной модификации (В). Сплошные стрелки отражают обычный путь переноса генетической информации, прерывистые - более редко используемые способы.

численности населения). Свое название "куру", или смеющаяся смерть, это заболевание получило потому, что ее сопровождают беспричинные приступы смеха, и человек вскоре погибает. Возникло подозрение, что этот нейродегенеративный недуг связан с ритуальным каннибализмом, поскольку чаще всего болели женщины и дети: им обычно доставался головной и спинной мозг умершего родственника. Предположение, что инфекционное начало находится именно там, подтвердилось, когда удалось заразить человекообразных обезьян инъекцией сыворотки, полученной из мозга человека, пораженного куру. Самое разумное объяснение данного факта - вирусное заболевание. Его характерной особенностью является длительный инкубационный период - годы и даже десятилетия.

Сходные с куру нейродегенеративные заболевания у человека - болезнь Кройцфельда-Якоба, синдром Герштмана-Штресслера-Шейнкера, а также смертельная бессонница; у овец - скрэпи, или почесуха, и похожие у коз, коров, мышей, других млекопитающих относятся к категории губчатых энцефалопатии. Они названы так, поскольку мозг больного на последних стадиях заболевания на срезах напоминает губку или швейцарский сыр.

Но вот что интересно: хотя "вирусная" гипотеза в течение нескольких десятилетий была общепринятой, тем не менее, несмотря на упорные усилия специалистов, соответствующих переносчиков так и не нашли. Более того, инфекционное начало всегда ассоциировалось с белками, выделенными из мозга больных, в частности, с так называемыми амилоидными тяжами и бляшками, образующимися при губчатых энцефалопатиях. В результате родилась концепция природы возбудителя, подчеркивавшая, что для его передачи необходим и достаточен именно белок, а не нуклеиновые кислоты. Этот белок получил название прион (анаграмма от proteinacious infection). За развитие этой концепции американец С. Прусинер в 1997 г. получил Нобелевскую премию.

Исследования ученого и его коллег выявили: инфекционные амилоиды представляют собой агрегаты из молекул белка, идентичных по своей первичной структуре, т. е. по чередованию аминокислот в полипептидной цепи, белку нервной системы PrP ^c (PrP - от prion protein, а C - от cellular, клеточный). Функция этого белка неизвестна до сих пор. Но ясно одно: превращение нормального белка в инфекционную прионную форму, обозначаемую как PrP ^Sc (Sc - от scrapie), связано с изменением его пространственной структуры. Она обогащена так называемыми (3-слоями, которые, по-видимому, ответственны за агрегацию отдельных молекул с образованием амилоидов.

Благодаря этим открытиям возникла идея о том, что белки сами по себе могут быть генетическим материалом, т. е. могут переносить и воспроизводить наследственную информацию без участия нуклеиновых кислот. Однако эта сенсация просуществовала не долго. Вскоре у млекопитающих открыли структурный ген PRNP, кодирующий белок PrP. Правда, и тот, и другой не очень-то нужны организму. Мыши, лишенные этого гена, вполне жизнеспособны и не страдают какими-либо наследственными заболеваниями. Напротив, они становятся устойчивыми к заражению прионами, переносящими скрэпи. Значит, инфекционная молекула PrP ^Sc , попадая в здоровый организм, "перестраивает" нормальный белок PrP ^c "по своему образу и подобию" и тем самым приводит к лавинообразному росту амилоидов, разрушающих мозг больного.

Белок PrP - весьма консервативен у всех млекопитающих. Его первичная структура очень похожа у самых разных видов, особенно это характерно для начальной части белка, содержащей повторы аминокислот. Благодаря открытию структурного

стр. 63

Человеческий мозг на последней стадии болезни Кройцфельда- Якоба.

Амилоидные бляшки (окрашены в черный цвет) в тканях головного мозга человека, пораженного болезнью Кройцфельда-Якоба.

гена, кодирующего белок-прион, было доказано: инфекционные амилоидозы - болезнь Кройцфельда-Якоба, синдром Герштмана-Штресслера-Шейнкера, смертельная бессонница у человека и заболевания, подобные скрэпи, у других млекопитающих - возникают тремя путями: инфекционным - при заражении прионами; наследственным - из-за мутаций гена PRNP; спорадически - вследствие спонтанного превращения PrP ^c -> PrP ^Sc .

У человека перечисленные выше амилоидозы сравнительно редки - в среднем регистрируют один случай на 1 млн. в год. Тем не менее интерес к этому классу заболеваний весьма высок, чему в немалой степени способствовала вспышка коровьего бешенства (точнее, болезни BSE - Bovine Spongiform Encephaopathy - губчатая энцефалопатия коров) в 80-е годы XX в. в Великобритании. Эта эпизоотия принесла огромные убытки европейским производителям говядины. Более того, оказалось, что BSE заразна для людей. В последние годы зарегистрированы около 100 случаев новой формы болезни Кройцфельда- Якоба, при которой белок PrP ^c , выделенный из мозга больных людей, напоминает по свойствам PrP ^Sc коров, пораженных BSE. Еще одной особенностью новой формы болезни Кройцфельда-Якоба стало ее "омоложение": ей теперь подвержены совсем молодые люди и даже подростки, в то время как ранее страдали только взрослые.

Белки-прионы обнаружены и у обычных хлебопекарных дрожжей, и некоторых других грибов. Конечно, у них они не имеют никакого отношения к нервной системе и выполняют совсем другие клеточные функции. Однако по ряду свойств ведут себя как прионы млекопитающих. Их обнаружение - прекрасная иллюстрация того, что научные открытия, как правило, не внезапные озарения, а результат длительного труда коллектива. Проследим вкратце историю изучения одного из дрожжевых прионов.

В 1965 г. британский генетик Б. Кокс описал необычный цито-плазматический наследственный детерминант дрожжей и назвал его [PSI]. Как мы теперь знаем, в присутствии [PSI] дрожжевая клетка ошибается при считывании генетического кода. Это проявляется в том, что в несущих [PSI] клетках происходит считывание стоп-кодонов* как значащих. Поясним: речь идет о специальных сигналах, которыми заканчивается каждый ген. Они "дают понять" соответствующему считывающему устройству, где необходимо закончить синтез данной белковой молекулы. Такой сигнал состоит из трех нуклеотидов и может быть трех типов: УАА, УАГ или УГА (У - урацил, А - аденин, Г - гуанин). В норме они не считываются молекулами транспортных РНК, поскольку не кодируют ни одну из 20 аминокислот, из которых строятся молекулы белка. В этом можно убедиться, если за счет мутации любой из этих сигналов ввести не в конец, а в начало или в середину гена (это называют нонсенс-мутациями). В клетке возникает дефицит какого-либо метаболита или другие проблемы, связанные с отсутствием белка-продукта мутантного гена. Стоит, однако, появиться [PSI], и "ложные" сигналы терминации считываются как значащие кодоны. Чуть позже мы поясним, почему так происходит, сейчас же важно, что в присутствии [PSI] синтез соответствующего белка возобновляется и клеточные функции восстанавливаются. Это явление названо нонсенс-супрессией, поскольку в его основе лежит подавление проявлений нонсенс-му-

* Кодон - единица генетического кода, состоящая из трех последовательных нуклеотидов в молекуле ДНК или РНК (прим. ред.).

стр. 64

таций (правильнее говорить о восстановлении нормы).

Главная особенность [PSI] заключается в том, что его наследование не связано ни с ядром, ни с митохондриями - клеточными структурами, в которых находится ДНК. Проведенные анализы показали: [PSI] передается с цитоплазмой, однако попытки найти какую-либо нуклеиновую кислоту, с которой ассоциировались бы свойства [PSI], не увенчались успехом. В результате примерно 30 лет [PSI] оставался неким мистическим наследственным детерминантом.

Природа [PSI] была установлена лишь в 90-е годы XX в. Правда, в 1964 г. на нашей кафедре у дрожжей открыли два гена, согласно международной номенклатуре, обозначаемые теперь SUP35 и SUP45. Мутации в этих генах, как и [PSI], приводили к считыванию стоп-кодонов, т. е. тоже были нонсенс- супрессорами. Было похоже, что белки, кодируемые данными генами, имеют прямое отношение к терминации синтеза белка. Ведь их функция как раз и состоит в том, чтобы опознавать кодоны-терминаторы и тем самым предотвращать возможность их считывания как значащих. Это подтвердили наши совместные работы с французскими (М. Филипп, Университет города Ренн) и московскими (академик Л. Л. Киселев, Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН) коллегами.

Сходство в проявлении [PSI] и мутаций выявленных нами генов подсказало еще одну гипотезу. Может быть, эти гены, или один из них, имеют какое-то отношение к кодированию [PSI]? В начале 90-х годов, изолировав ген SUP35 и вернув его в клетку дрожжей в виде многих копий, мы обнаружили: клетка [PSI ^- ] превращается в клетку [PSI ⁺ ]. Между тем Р. Уикнер из Национального института здоровья (США) на основе, в том числе, и наших данных предположил, что [PSI] и [URE3] - дрожжевые прионы. ([URE3] - цитоплазматический фактор, контролирующий обмен наследственности).

Затем тот же эффект - индукция [PSI] - был достигнут при повышенной экспрессии SUP35. Это было сделано нами вместе с С. Либман из Университета Иллинойса (Чикаго). Основную часть работы сделала аспирантка нашей кафедры И. Деркач. Важно, что индукция [PSI] наблюдалась только при увеличении количества белка, кодируемого геном SUP35. Если нарабатывалась мРНК, соответствующая лишь гену SUP35, а синтез белка блокировался, то эффекта не было. Все это отлично согласовывалось с предположением о белковой природе [PS1]. Ко времени описываемых событий полная структура гена SUP35 у дрожжей была расшифрована нами совместно с сотрудниками Института экспериментальной кардиологии (Москва), где тогда начал работать выпускник и сотрудник нашей кафедры М. Д. Тер-Аванесян (ныне он возглавляет лабораторию молекулярной генетики в упомянутом институте). Анализ нуклеотидной последовательности гена SUP35 показал, что кодируемый им белок весьма необычен по строению. Начальная его часть содержит последовательности аминокислот, необходимые для перехода белка в прионное состояние. При этом образуются агрегаты - фибриллы, напоминающие амилоиды млекопитающих. Происходит это не только в живой клетке, но и in vitro (в пробирке), как показал позже М. Д. Тер-Аванесян и его коллеги.

Таким образом, способность приона к передаче какого-либо наследственного свойства (в случае фактора [PSI] - считывание кодонов-терминаторов) объясняется тем, что нормальный клеточный белок, обладающий некоторыми структурными особенностями (специфической последовательностью аминокислот), способен менять характер своей пространственной укладки, а затем передавать это другим молекулам такого же белка. В результате образуются и растут сначала белковые фибриллы, а затем и более крупные агрегаты.

Как было показано в совместной работе с другим выпускником и со-

Схема событий, происходящих на стоп-кодоне (2) в клетках [psi-] (A) и [PSI ⁺ ] (В). В отсутствие [PSI ^- ] стоп-кодон (обозначен красным) узнается факторами терминации, в результате синтез белка прекращается, а компоненты белоксинтезирующего аппарата диссоциируют. В клетках [PSI ⁺ ] фактор терминации, кодируемый геном SUP35, образует агрегаты, которые не могут принимать участие в терминации белкового синтеза. В результате стоп-кодон считывается молекулами тРНК как значащий, и синтезируется полноразмерный белок.

стр. 65

Агрегаты белка SUP35 в клетках дрожжей, содержащих [PSI ⁺ ].

Фибриллы, образуемые белком SUP35 in vitro.

трудником нашей кафедры Ю. О. Черновым (в то время работавшим в лаборатории С. Либман, ныне - руководителем лаборатории в Техническом университете Джорджии, Атланта), важную роль в наследовании прионов играет другой белок, обозначаемый Hsp104. Он "отгрызает" небольшие куски от белковых агрегатов, образуя "семена". Последние попадают в дочерние клетки дрожжей при почковании. Вместе с ними передается и свойство молекул белка SUP35 образовывать агрегаты, приводящие к его инактивации со всеми вытекающими последствиями (прежде всего, к считыванию стоп-кодонов). В случае белка, кодируемого геном SUP35, за это свойство отвечает участок, находящийся в начале молекулы. Если его присоединить к какому-либо чужеродному белку, тот приобретает способность к прионизации. Значит, белки могут быть носителями наследственных свойств, хотя они и неспособны к самовоспроизведению, как нуклеиновые кислоты. Как было отмечено ранее, это не отменяет центральную догму молекулярной биологии, но позволяет внести в нее существенное дополнение. В настоящее время главные усилия исследователей дрожжевых прионов направлены на выяснение деталей "жизненного цикла" прионов, т. е. на то, как они возникают, растут, образуют семена и, тем самым, как "размножаются". Кроме хорошо изученных прионов [PSI] и [URE3], в последнее время у дрожжей выявлены и другие цитоплазматические наследственные факторы, обладающие свойствами прионов. В частности, в нашей лаборатории обнаружены детерминанты [ISP] и [ASP]. Сегодня ведем поиск соответствующих структурных генов для этих прионов.

Дрожжевой прион, обнаруженный нами в сотрудничестве с лабораторией С. Либман, назвали [PIN]. Было показано: от него зависит появление приона [PSI] (отсюда и обозначение - Psi INduction). Найден и структурный ген RNQ1, кодирующий [PIN]. Его функция пока неизвестна.

Открытие и исследование [PIN] позволило вскрыть еще одну особенность прионов дрожжей. Оказалось: в клетке существует своеобразная "сеть" прионных взаимодействий, вследствие чего появление соответствующей формы одного белка индуцирует аналогичные превращения других, потенциально способных. Доказательства получили И. Деркач в лаборатории С. Либман и Л. Ошерович в лаборатории Дж. Вайсмана в Университете Сан-Франциско (США). Этой работе предшествовали интересные теоретические обоснования Вайсмана, обратившего внимание на то, что белки, способные к прионизации (точнее, их участки, ответственные за такое превращение), обогащены повторами двух аминокислот - глутамина и аспарагина. На этом основании он составил список белков, потенциально способных к прионизации у разных объектов: у дрожжей - 107, что составляет около 2% всех белков, синтезируемых в их клетке, у дрозофилы - 472, или около 3,5%. Важно подчеркнуть: в списке Вайсмана присутствуют все четыре белка дрожжей, для которых способность к прионному превращению уже доказана.

Открытие прионов дрожжей очень важно для дальнейшего развития этой области исследований. Прежде всего - это отличный модельный объект, молекулярная генетика которого прекрасно разработана, а структура генома полностью расшифрована еще в 1996 г. Дрожжи стали первым эукариотическим* объектом с расшифрованным геномом. Кстати, все эукариотические клетки (и человека) устроены по одному принципу, поэтому результаты генетических исследований дрожжей можно, хотя и с оговорками, переносить на животных и людей. Вот почему, выясняя закономерности возникновения размножения и передачи прионов у дрожжей, можно искать пути борьбы с соответствующими заболеваниями у человека и животных (что уже практикуется!).

Иллюстрации предоставлены авторами и К. Волковым.

* Эукариоты - организмы, обладающие оформленным клеточным ядром, отграниченным от цитоплазмы ядерной оболочкой (прим. ред.).

Постоянный адрес данной публикации: