Автор: Петров Р.В., Михайлова А.А., Фонина Л.А.

Академик Р. В. ПЕТРОВ,

Доктор биологических наук А. А. МИХАЙЛОВА,

Кандидат химических наук Л. А. ФОНИНА,

Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Пептидная регуляция - одна из ключевых проблем современной молекулярной биологии, в том числе молекулярной иммунологии. Большинство веществ- медиаторов иммунной системы по своей природе являются полипептидами или протеинами. Они - передатчики сигналов между различными иммуно-компетентными клетками, обеспечивают их взаимодействие в процессе развития иммунной реакции.

Регуляторные пептиды играют важную роль в функционировании центральных органов иммунной системы - тимуса и костного мозга. Два этих органа ответственны за развитие и нормальное функционирование Т- и В-систем иммунитета. И за счет огромного разнообразия вырабатываемых там регуляторных молекул - цитокинов - происходит сложная цепь событий, обеспечивающих нормальную работу иммунной и кроветворной систем.

В отличие от пептидов тимуса, выявленных в середине 60-х годов и ныне детально изученных, пептиды костного мозга не были известны до середины 70-х годов, когда их открыли в нашем коллективе и назвали миелопептидами (МП).

Первые МП обнаружены в экспериментах со смешанными культурами. В них клетки, продуцирующие антитела (АПК) - лимфоидные клетки мышей, иммунизированных эритроцитами овцы, - культивировали вместе с клетками костного мозга неиммунных мышей. Оба типа клеток находились в общем сосуде, но их разделяла мембрана, не пропускающая клетки, однако не препятствующая "проходу" веществ, вырабатываемых ими. В результате оказалось: количество АПК в суспензии иммунных лимфоидных клеток увеличивалось в 2 - 3 раза по сравнению с контрольными, не содержащими костно-мозговых клеток под мембраной. Так удалось доказать, что клетки костного мозга образуют гуморальные факторы, влияющие на уровень продукции антител в популяции зрелых АПК.

Активная фракция, включающая МП, была выделена из 20- часовой культуры клеток костного мозга мышей (позднее - свиней) методом гельхроматографии. Она содержала вещества с молекулярной массой 500 - 5000. Да и обладала тремя типами активности: иммунорегулирующей, клеточно- дифференцирующей и нейротропной.

Дальнейшие эксперименты показали: МП вырабатываются клетками костного мозга животных и человека в процессе их жизнедеятельности без антигенной или митогенной стимуляции. Они лишены видовой специфичности и, будучи выделены из клеток костного мозга животных, могут применяться для иммунокоррекции человека. Это способствовало созданию нового иммуномодулятора миелопида, ныне широко применяемого в отечественных клиниках для лечения многих заболеваний, связанных с расстройствами иммунной и кроветворной систем. Он предотвращает послеоперационные посттравматические осложнения, способствуя нормализации иммунитета больного. Препарат также оказывает положительный эффект при лечении хронического бронхита и воспаления легких, некоторых бактериальных инфекций и при комбинированной терапии острых лейкозов.

Детально изучать биологические свойства МП и механизмы их действия нельзя, не понимая химическую структуру этих соединений, что, в свою очередь, требовало наличия последних в достаточном количестве. Однако сами по себе метаболизирующие клетки костного мозга вырабатывают МП в чрезвычайно низких концентрациях. Они присутствуют в надосадочной жидкости, нотам преобладают компоненты различной химической природы (аминокислоты, витамины, нуклеиновые основания, соли и др.). Вот почему нам предстояло разработать метод, позволяющий выделить чрезвычайно малые дозы МП из большого объема культуральной жидкости (примерно 500л) с минимальными потерями биологически активных пептидов.

Для выделения индивидуальных МП из культуральной жидкости мы решили базироваться на принципе твердофазной экстракции. Суть заключается в том, что супернатант пропускали через высокомолекулярный сорбент (микропористый полимер форсарт отечественного производства), поглощающий не только МП, но и те компоненты культурной фазы, которые по-иному практически не сорбируются. Далее мы смывали МП с полимера. Эти мани-

стр. 114

пуляции обеспечили отделение биологически активных МП почти от всех компонентов культуральной среды лишь за одну стадию и позволили концентрировать раствор до небольшого объема. Важно и то, что полученный раствор сохранил все типы искомой биологической активности, присущие исходному супернатанту. Дальнейшее разделение смеси МП осуществляли обращенно-фазовой хроматографией, на каждом этапе процесса тестируя отобранные образцы на биологическую активность.

Сравнение полученных структур со структурами известных белков и полипептидов, представленных в банке данных, показало: пептиды МП-1 и МП-2 идентичны консервативным фрагментам а- и (3-цепей гемоглобина, а МП-3 -МП-6 не имеют сходства с известными структурами.

Идентифицированные МП были синтезированы и более тщательно изучены их биологические свойства.

Иммунокоррегирующее действие МП-1 испытали на различных экспериментальных моделях иммунодефицита, у- облучение мышей в дозе 300 бэр снижало у них выработку антител до 36,8 %. Введение МП-1 облученным мышам в дни 0,1,2 и 3 после иммунизации эритроцитами овцы привело к росту выработки антител. Максимальный эффект (до 80 % от нормального уровня) наблюдали при его дозе в 1х10 ^{- 9} г/мышь. Дозы в 1х10 ^-6 , 1х10 ^-7 и 1х10 ^-8 г/мышь вызывали менее сильное (до 50 - 60 %), но статистически достоверное увеличение образования антител. Дозы в 1х10 ^-5 и 1х10 ^-10 г/ мышь не приводили к иммунокоррекции. Пептид МП-2, в отличие от МП- 1, в большинстве использованных доз не оказывал иммунокоррегирующего воздействия.

Иммунокоррегирующее действие МП-1 проявлялось и у мышей, получавших циклофосфамид (ЦФ) - соединение, подавляющее иммунный ответ. Его вводили вдозе 200 мг/ кг, а через 9 дней животных иммунизировали эритроцитами овцы. Затем в дни 0, 1, 2 и 3 после иммунизации животным четыре раза вводили МП-1 или МП-2. И установили: в дозе 1X10 ^{- 6} г / особь МП-1 восстанавливал количество АП К в селезенке мышей с иммунодефицитом до нормального уровня. МП-2 не действовал коррегирующе на продукцию антител у мышей, получивших ЦФ.

Кроме моделей иммунодефицита, вызываемого облучением или применением цитостатика, использовали особей линии с врожденными пороками иммунной системы. МП-1 вызывал у них нормализацию некоторых иммунологичес-ких параметров. Специальные исследования показали, что это связано с его способностью тормозить Т-супрессорную функцию в продуктивной фазе иммунной реакции. Совместное культивирование зрелых АПК (клетки лимфатических узлов иммунизированных мышей) и Т-супрессоров (клетки мышиной селезенки, активированные конкавалином А) привело к двухкратному снижению производства антител. Присутствие МП-1 в той же смешанной культуре предотвращало ингибирующее влияние Т-супрессоров на количество АП К. Это указывает на способность МП-1 влиять на взаимодействие регуляторных Т-лимфоцитов (Т-помощников или Т-супрессоров).

Используя МП-1 с нанесенной на него флуоресцентной меткой ФИТЦ, мы изучали, как он связывается с рецепторами клеток- мишеней, и обнаружили 18 % ФИТЦ-положительных клеток в суспензии клеток селезенки мыши. Добавление к инкубационной смеси немеченого МП-1 в избыточных количествах вызывало уменьшение числа ФИТЦ- положительных клеток, т. е. шло вытеснение меченого пептида из мест связывания. Показано также, что связывание МП-1 с клетками-мишенями носит специфический характер, поскольку добавление вместо немеченого МП-1 другого пептида (МП-2) не привело к вытеснению ФИТЦ, меченного МП-1. Используя моноклональные антитела, присоединяющиеся к поверхностным маркерам только определенных типов Т-клеток (Т-помощников или Т- супрессоров), и меченый МП-1, мы выявили: клеткой-мишенью для МП-1 является Т-помощник.

Таким образом, МП-1 - иммунорегуляторный пептид. Он реализует свой иммунореагирующий эффект, воздействуя на соотношение активностей Т-супрессоров и Т-помощников благодаря способности связываться со специфи-

стр. 115

ческими рецепторами на поверхности Т-помощников. Поэтому он способен восстанавливать баланс регуляторных Т-клеток, нарушение которого лежит в основе многих иммунодефицитных состояний.

Противоопухолевую активность МП-2 мы впервые выявили в модели, оценивающей функциональное состояние Т- лимфоцитов - клеток, играющих ведущую роль в борьбе иммунной системы с опухолью. Функциональное состояние Т- лимфоцитов характеризуется по их способности отвечать пролифирацией (размножением) на митоген, скажем, на фитогемагглютинин (ФГА). При добавлении к человеческим Т- лимфоцитам надосадочной жидкости от лейкозных клеток HL- 60 (миелобластный лейкоз человека) пролифиративный ответ Т-лимфоцитов на ФГА снизился вдвое из-за воздействия опухолевых токсинов на функцию Т-клеток. Но когда в ту же культуру добавили МП-2, ингибирующий эффект опухолевых токсинов на функциональное состояние Т-лимфоцитов не проявился. Степень восстановления функции Т-лимфоцитов под влиянием МП-2 зависела от дозы пептида. Оно было максимальным (95% от нормы) при концентрации МП-2 100 мкг/ мл.

Анализ методом проточной цитометрии показал: человеческие Т-лимфоциты, подвергнутые действию опухолевых токсинов, имели уменьшенную пропорцию Т-помощников ( CD ⁺ ₄ клеток). В то же время не было изменений в количестве CD ⁺ ₈ клеток (т. е. Т- супрессоров). МП-2, добавленный к этим "подавленным" Т- клеткам, полностью восстановил CD ⁺ ₄ фенотип, поврежденный лейкозными клетками.

Способность МП-2 возобновлять функциональную активность Т-лимфоцитов, угнетаемую опухолевыми клетками, вероятно, - основа противоопухолевого воздействия этого пептида в опытах на мышах. Во всяком случае, введение им МП-2 на третий день после пересадки опухоли привело к сдерживанию ее роста на 70 - 80 %. Причем происходило это на различных типах опухолей: лимфолейкоза Р-338, аденокарциномы молочной железы Са-755, саркомы S-180, меланомы В-16 и др.

Мы предполагаем, что МП-2 является эндогенным иммунорегуляторным пептидом, участвующим в антиканцерогенных механизмах. Он предохраняет иммунную систему от опухолевых токсинов и перспективен для профилактики и лечения рака.

Макрофаги - мишень для еще одного пептида МП-3; он стимулирует захват ими чужеродных частиц (т. е. фагоцитоз), что ярко проявилось на мышах, инфицированных патогенными микроорганизмами.

Максимальная стимуляция фагоцитоза происходит при дозах МП-3 10 ^-7 - 10 ^-8 г / мл и достигает 250 %. Эти данные мы получили в модельных экспериментах, когда макрофаги, выделенные из перитональной полости мыши, помещали в пробирку и туда же добавляли эритроциты овцы. Первые захватывали вторых, а степень фагоцитоза оценивали по "кислородному взрыву", сопровождающему процесс.

Стимуляция макрофагиального фагоцитоза под влиянием МП- 3 проявилась и в опытах на инфицированных мышах. Захватывая инфицирующие микробы, он защитил их от гибели (в группе 1 пептид вводили в дозе 0,5х10 ^-4 г / особь, в группе 2 - 1х10 ^-6 г / особь). 24 ч спустя этих животных инфицировали сальмонеллой тифимуриум 415 (10 ² , 10 ³ , 10 ⁴ или 10 ⁵ бактериальных клеток / мышь). А мышей контрольных групп обработали солевым раствором. При 100 %-ной смертности животных в контроле (10 ⁴ и 10 ⁵ бактериальных клеток / мышь) выживаемость в группах, обработанных МП-3, достигала 70 - 90 %. Похоже, этот пептид предохраняет животных от бактериальной инфекции, поскольку стимулирует фагоцитоз, и потому данный препарат в перспективе можно использовать в качестве лечебного средства при антибактериальной терапии.

Первоначально клеточная линия миелобластного лейкоза человека НL-60 была получена из костного мозга пациента, пораженного тяжелой формой данной болезни. Эти раковые клетки являются малодифференцированными блас-тоидными и интенсивно размножаются. Они могут дифференцироваться в более зрелые клетки крови только в присутствии специальных дифференцирующих агентов. И оказалось, что к таковым относится МП-4.

Чтобы установить культуру HL-60, клетки поддерживали в стандартной питательной среде. Три дня спустя в каждую внесли радиоактивные метки ³ Н-тимидин и ¹⁴ С-глицин. На 6-й день культивирования измерили синтез ДНК (по включению ³ Н-тимидина) и синтез белка ( ¹⁴ С-глицина). Ну, а поскольку произошло увеличение общего белкового синтеза (показатель клеточного созревания) при одновременном уменьшении синтеза ДНК (показатель клеточного деления), что характерно для клеточной дифференцировки, то стало ясно: МП-4 индуцирует соответствующий процесс. Влияние этого пептида на бластоидные клетки зависит от его дозы. Оптимальный эффект наблюдается при 0,1 - 5,0 мг / мл.

Морфологический анализ HL-60 клеток, обработанных МП-4, подтвердил данный вывод. Среди бластоидных клеток наблюдалось 60 % созревших форм (моноцитов и макрофагов).

Затем дифференцирующий эффект МП-4 сравнили с таковым известных дифференцирующих факторов, форболовым эфиром и препаратом, полученным из Т-лимфоцитов. И стало ясно: МП-4 является регуляторным пептидом, играющим значительную роль в клеточной дифференцировке. Без сомнения, он обещает стать эффективным средством лечения определенных форм лейкоза.

В настоящее время мы анализируем биологические свойства МП-5 и МП-6.

Итак, различные действия МП, их активность как in vitro, так in vivo, зависимость эффектов от дозы пептида, их селективное влияние на определенные клетки, связанные со специальными рецепторами на этих клетках-мишенях - все указывает на то, что они являются неизвестным ранее видом регуляторных соединений, занимающих важное место в жизнедеятельности организма.

Проблема МП важна и для клинической иммунологии. Как сказано выше, препарат миелопид, состоящий из смеси МП, эффективно применяют в нашей стране для коррекции расстройств иммунитета и кроветворения. Комбинация индивидуальных, структурно охарактеризованных МП с известным механизмом действия, открывает перспективу создания целенаправленных смесей МП, подходящих для лечения конкретного больного в зависимости от состояния его иммунного статуса.

Наука в России N 2, 1998

Постоянный адрес данной публикации: