Доктор биологических наук Георгий ПИНАЕВ, заведующий отделом клеточных культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург)

Всесоюзная (ныне Российская) коллекция клеточных культур создана 30 лет назад путем объединения девяти специализированных коллекций клеток человека, животных и растений.

Ныне в ее фондах хранится свыше 2700 клеточный линий, из которых 540 уникальны. Она обеспечивает более 270 отечественных научных и производственных учреждений эталонным материалом, что способствует развитию в нашей стране фундаментальных биологических исследований и созданию новых биотехнологий.

По сути все основные сведения о механизмах поведения клеток человека, животных и растений (процессах деления, миграции, изменения формы, взаимодействия между собой и с микроокружением, перерождения в злокачественные, экспрессии генов) получены в результате изучения клеток, выделенных из организма и поддерживаемых в жизнеспособном состоянии в соответствующих питательных средах. Эти работы были начаты еще в конце XIX в. немецким ученым Юлиусом Арнольдом, который в 1887 г. наблюдал за поведением выделенных и помещенных в лимфу лейкоцитов лягушки.

В первой трети XX в. основные усилия были направлены на выявление разного вида биологически

Типичные формы клеток разного происхождения:

a - эпителиоподобная,

b - фибробластоподобная,

c - нейроподобная,

d - клетки крови.

активных молекул, содержащихся в плазме крови, в лимфе, сыворотке, экстрактах тканей и необходимых для выживания и размножения культивируемых клеток. На следующем этапе удалось создать стандартные питательные среды, и к 1950-м годам клеточные культуры стали доступны широкому кругу лабораторий разных стран. Одновременно разрабатывали материалы и приборы, необходимые для анализа клеточных культур.

Сначала были получены первичные культуры, т.е. клетки, непосредственно выделенные из тканей организма. Затем оказалось, что их можно размножать и пересевать в культуре, и они получили название диплоидных (сохраняющих исходный состав хромосом и генетического материала) клеточных линий. В первую очередь к ним относятся фибробласты соединительной ткани, быстро нашедшие практическое применение для производства противовирусных вакцин и выявления наследственных генетических нарушений у человека. Оказалось, однако, что эти "нормальные" клетки имеют ограниченный срок жизни. А вот полученные позднее "трансформированные" постоянные линии могут существовать неограниченно долго. Благодаря изучению последних удалось приблизиться к пониманию основных проблем молекулярной биологии, генетики и медицины.

Исследования показали: хромосомный состав и свойства таких "бессмертных" клеток изменяются при смене питательной среды, типа сыворотки крови, условий культивирования и других элементов их окружения. Более того, по этой причине одни и те же клеточные линии из разных лабораторий могут иметь существенные различия.

Стало ясно: для сохранения исходных или направленно измененных свойств, а также для воспроизводства экспериментальных результатов необходимо зафиксировать определенное состояние культивируемых клеток. Это достигается строгим соблюдением поддерживаемых условий - температуры, влажности, параметров питательной среды и т.д. Кроме того, выяснилось: культивируемые клетки можно "криоконсервировать", т.е. сохранять в замороженном состоянии в жидком азоте при температуре -196 "С. А чтобы в них не формировались кристаллы льда, разрушающие их внутренние структуры, добавляли криофилактики - специальные ингредиенты, предотвращающие образование кристаллов льда в клетках и тем самым обеспечивающие их выживание после размораживания.

Сначала для этой цели использовали глицерин, затем диметилсульфоксид - растворитель, применяемый в производстве синтетических волокон и фармакологических препаратов. При соблюдении определенных режимов замораживания консервированные клетки могут храниться в жидком азоте десятилетиями, не меняя исходных свойств и не утрачивая жизнеспособности.

В итоге ученые разных стран пришли к единому выводу: надежно использовать клеточные культуры в научных и производственных учреждениях нельзя без специализированных центров. Именно такую роль и взяли на себя создаваемые национальные коллекции. Первую сформировали в США еще в 1925 г. Затем подобные появились в Германии, Англии, Японии, Китае, Франции, Италии, Дании. Эти коллекции становятся областью государственных и деловых интересов и основой для решения приклад-

a - нормальный кариотп человека (46 хромосом); b - преобладающий кариотп постоянной клеточной линии больного остеогенной саркомой (50 хромосом, из них 12 перестроены).

ных задач медицины, сельского хозяйства, биологической промышленности*. К их числу относятся массовое производство вакцин и физиологически активных соединений, получение моноклональных антител методами гибридомной** технологии, применяемых в диагностике онкологических, иммунных и других заболеваний, повышение продуктивности сельскохозяйственных животных и выведение новых сортов растений, сохранение биоразнообразия генофонда путем криоконсервации соматических и половых клеток. И, наконец, бурно развивающиеся в последнее время технологии клеточной терапии*** и клеточной инженерии на основе стволовых и других типов клеток для лечения тяжелых заболеваний человека (критические ожоги, трофические язвы, травмы костей и суставов, поражения сердца в результате инфарктов и т.д.).

В 1970-х годах на фоне общемировых успехов в области молекулярной и клеточной биологии, молекулярной генетики и биотехнологии в нашей стране выявили невозможность интенсивного развития исследований с широким использованием клеточных культур из-за отсутствия централизованной коллекции и отсталости материально-технической базы. Существовавшие в отдельных институтах собрания были невелики по объему, узко специализированы, как правило, недостаточно охарактеризованы. Они не предназначались для обеспечения необходимых работ, ведущихся в других научных учреждениях. И в мае 1978 г. Межведомственный научно-технический совет по проблемам молекулярной биологии и молекулярной генетики при Государственном комитете по науке и технике и Президиуме АН СССР принял решение о создании Всесоюзной коллекции, в задачи которой вменялся сбор, характеризация и сохранение клеточных культур человека, животных, растений и обеспечение ими научных учреждений страны. Руководство и координацию ее работы возложили на комиссию во главе с директором Института цитологии АН СССР (Ленинград), членом-корреспондентом АН Афанасием Трошиным, его заместителями - членом-корреспондентом АН Раисой Бутенко и автором данной статьи. Наш Институт был определен научно-методическим и информационным центром нового объединения.

Первыми его членами стали институты Цитологии, Физиологии растений им. К. А. Тимирязева АН СССР, Вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН СССР, Институт вирусных инфекций Минздрава РСФСР (Свердловск). В дальнейшем в сообщество вошли институты Медицинской генетики АМН СССР, Общей генетики АН СССР, НИИ гриппа Минздрава СССР, Экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко ВАСХНИЛ.

В феврале 1981 г. была утверждена программа работ до 1985 г. В ее рамках утвердили задание "разработать методы характеризации, низкотемпературной консервации, контроля загрязнений клеточных линий, а также консервации геномов исчезающих и редких видов животных". Головным учреждением по проблеме опять стал наш Институт.

В результате сформулировали общую стратегию и тактику развития Коллекции, ревизовали имевшийся в отдельных фондах материал, унифицировали требования к его паспортизации, контролю качества и хранению на уровне современных международных

* См.: А. Баев. Арсенал биотехнологии. - Наука в СССР, 19X6, N 2; А. Яненко. Приоритеты промышленной биотехнологии. - Наука в России, 2006, N 5; Ю. Рамазанов и др. Рожденные... в газовом вихре. - Наука в России, 2007. N 2 (прим. ред.).

** Гибридома - клеточный гибрид, получаемый слиянием нормальной клетки с опухолевой. Обладает способностью к синтезу специфического белка, например антитела (свойство нормальной клетки), и к неограниченному росту (свойство опухолевой клетки). Синтезируемые гибридомные моноклональные антитела применяют во многих областях биологии и медицины (прим. ред.).

*** См.: А. Дыгай, Г. Зюзьков. Клеточная терапия: новые подходы. - В этом номере журнала (прим. ред.).

норм, а также установили общие правила работы с культурами. Одновременно стимулировали выпуск отечественной промышленностью необходимых приборов и устройств.

Уже первая ревизия фондов показала: в них нет ни одной линии, полностью охарактеризованной по международным стандартам, и только 38 были признаны условно коллекционными. Поэтому первоочередными задачами стала паспортизация имевшегося материала и расширение фондов. Последние пополняли разными способами: наряду с приобретением образцов из Американской типовой коллекции клеточных культур практиковали обмен с другими национальными собраниями, передачу авторских линий из научных лабораторий и выведение новых непосредственно в специализированных собраниях. Наладили постоянные связи с США, Германией, Болгарией, Великобританией, Италией.

Однако вскоре стало ясно: указанным в паспорте данным соответствовали только приобретенные в национальных коллекциях. А присланные из самых разных исследовательских лабораторий такой "чистотой" не обладали, ибо культуры клеток, с которыми там работали, как правило, теряли исходные характеристики в силу произвольного изменения условий их культивирования и хранения. Из-за отсутствия постоянного контроля они часто были заражены микоплазмой* или смешаны с клетками другого происхождения. Так, в начале существования отечественной Коллекции из 95 полученных линий 88 оказались зараженными. В связи с этим в 1981 - 1985 гг. был разработан определенный порядок введения в фонды нового материала.

Теперь все вновь поступающие линии выдерживают в карантине для определения чистоты культуры. Затем клетки размножают и закладывают на хранение до тех пор, пока они не будут полностью охарактеризованы согласно пунктам специального паспорта. Лишь пройдя такой отбор, они переходят в разряд коллекционных и становятся доступными для потребителя.

Расширение фондов в первую очередь определяло запросы фундаментальных исследований, потребности биомедицинской промышленности и практические задачи здравоохранения. Например, в начале расцвета биотехнологии в нашей стране, пришедшегося на конец 1980-х годов, основное внимание специалисты сосредоточили на приобретении и выведении клеток животных и растений - продуцентов биологически активных веществ. Отмечу: именно в Коллекции получены у нас первые гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела для диагностики и терапии опасных заболеваний (в 1988 г. старший научный сотрудник нашего Института, кандидат биологических наук Ирина Фридляндская с сотрудниками получили первые антитела к гамма-интерферону, а затем к вирусу гепатита).

Государственная научно-техническая программа "Геном человека" стимулировала значительное расширение спектра линий клеток из разных тканей ор-

* Микоплазма - класс бактерий, не имеющих клеточной стенки и ограниченных плазматической мембраной. Патогенные микоплазмы вызывают болезни человека, животных и растений (прим. ред.).

ганизма. А необходимость обеспечения санэпидстанций качественным клеточным материалом индуцировала получение линий и клонов, пригодных для выявления вирусных инфекций.

Как уже упоминалось, в задачу Коллекции входит не только обеспечение сохранности линий, но и их подробное описание. Для этого используют клетки ранних пассажей после размораживания криоконсервированного материала. Причем ввиду специфики работы в разных институтах описание свойств даже сходных линий значительно различалось. В этой связи пришлось определить необходимые и достаточные характеристики, позволившие создать единый паспорт с модификациями для соматических клеток человека, животных и растений. В обязательном перечне - четыре параметра.

Во-первых, жизнеспособность, т.е. число клеток данной линии, выживающих после криоконсервации. Этот показатель устанавливают по эффективности клонирования, окрашиванию витальными красителями и скорости увеличения клеточной массы в процессе культивирования.

Во-вторых, морфология клеток, зависящая от их тканевого происхождения, фиксируемая микрофотографиями, а также тип роста в культуре. Последний демонстрируется формой клеток, их межклеточными связями и характером заполнения пространства в процессе культивирования. Так, фибробластоподобные клетки имеют веретеновидную форму, эпителиоподобные - полигональную или округлую.

В-третьих, видовая и тканевая идентификация линий, поскольку в условиях культивирования клетки различных видов и тканей морфологически неразличимы. Кроме того, из-за возможных технических ошибок персонала может происходить перекрестное заражение клеток разных линий (явление довольно частое, особенно в условиях лабораторий, где нет должного контроля).

В-четвертых, заражение культур микроорганизмами - грибами, бактериями, микоплазмами, вирусами, что решает дальнейшую судьбу данной клеточной линии. Причем наибольшую опасность представляют микоплазмы, поскольку во многих случаях контаминация (смешение) такого рода протекает бессимптомно, а их латентное присутствие существенно влияет на метаболизм клеток, вызывает хромосомные аберрации, приводит к изменению функций. Освободиться же от этих паразитов очень сложно.

Кроме перечисленных основных характеристик, в паспорт заносят ряд данных, важных для специалистов: указание типа питательной среды и сыворотки; способ культивирования; среда для замораживания, способ и режим криоконсервации, тип криофилактика; чувствительность к вирусам; специфические особенности линии, включающие ее туморогенность (способность инициировать опухолевый процесс), наличие биохимических и генетических маркеров. Словом, каждую поступающую в коллекцию клеточную культуру тщательно анализируют по многим параметрам, прежде чем ее включат в состав фондов.

В 1987 г. Государственным институтом патентной экспертизы была обоснована необходимость патентования штаммов культивируемых клеток животных и растений, представляющих практическую ценность для народного хозяйства. В их число входят клетки-продуценты биологически активных веществ, используемые для производства иммунобиологических

препаратов и диагностикумов, а также гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела. Производство антител необходимо для выявления в клетках и тканях соединений, имеющих патогенное влияние, или белков, характерных для разных заболеваний. Кроме того, они используются для направленной доставки лекарственных веществ в клетки опухолей или другие патологически измененные клетки.

Все патентуемые линии должны депонироваться в одной из официальных коллекций для хранения и выдачи образцов референтных штаммов - речь идет о специализированных подразделениях Всесоюзной (ныне Российской) коллекции клеточных культур. С 1988 по 2008 г. в разных ее отделениях было зарегистрировано свыше 700 гибридом и других линий, причем жизнеспособность каждой культуры должна проверяться в течение 30 лет с момента выдачи патента.

В настоящее время Коллекция состоит из девяти специализированных подразделений. Коллекция культур клеток позвоночных, называемая Центральным банком культивируемых клеток человека и животных, сосредоточена в Институте цитологии РАН (руководители - автор данной статьи и доктор биологических наук Галина Полянская). Ее профиль - изучение фундаментальных основ биологии клетки, выведение новых линий, создание гибридом, депонирование культур, имеющих промышленное значение. В числе наших задач - выпуск соответствующих каталогов, действенность информационной службы.

Коллекция клеток высших растений собрана Институтом физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН (руководитель - кандидат биологических наук Ирина Смоленская). Здесь изучают роль возможных повреждений при глубоком замораживании, ищут методы криоконсервации культур, занимаются селекцией и отбором штаммов сверхпродуцентов (штамм с высоким выходом полезного продукта, например, лекарственного вещества). Тут же расположена еще одна коллекция - генетически-трансформированных корней растений, возглавляемая кандидатом биологических наук Инной Кузовкиной. В числе ее приоритетов - поиск физиологически активных веществ в ценных лекарственных и сельскохозяйственных видах, способов сохранения генофонда, находящегося под угрозой исчезновения.

Коллекцию постоянных линий клеток беспозвоночных хранят в Институте общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН (руководитель - доктор биологических наук Виталий Какпаков). Наряду с изучением генетики соматических клеток здесь разрабатывают тест-системы для экологического цитомониторинга, изучают подвижные генетические элементы, выясняют, насколько чувствительны к вирусам клетки беспозвоночных.

В Институте вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН - коллекция перевиваемых* соматических клеток позвоночных (руководитель - доктор медицинских наук Раиса Подчерняева). В ней сосредоточен материал, используемый главным образом в медицине. Специалисты выводят линии, чувствительные к вирусам, ищут методы культивирования для производства вакцин.

Еще одна коллекция находится в Институте гриппа РАМН (руководитель - кандидат биологических на-

* Перевиваемые клетки можно культивировать, пересевая их в течение длительного времени (прим. ред.).

Корни шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis), внесенного в Красную книгу, содержат флавоны (на иллюстрации представлены химической формулой), обладающие высокой антибактериальной, цитостатической и гипотензивной активностью. В культивируемых в лаборатории аналогах эти вещества присутствуют в количестве, сопоставимом с их содержанием в целом растении (НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН).

ук Татьяна Смирнова). Профиль - сбор, поддержание и выведение новых культур диплоидных клеток для исследования взаимодействия с ними вирусов, поиск методов тестирования последних, производства вакцин и диагностических препаратов.

В коллекции Медико-генетического научного центра РАМН (руководитель - кандидат биологических наук Сергей Терехов) сосредоточены образцы соматических клеток человека от больных наследственными заболеваниями. Их применяют для выявления соответствующих молекулярных механизмов.

Коллекция перевиваемых клеток человека и животных медицинского назначения размещается в Екатеринбургском НИИ вирусных инфекций Минздрава РФ (руководитель - доктор медицинских наук Нина Глинских). Ее назначение - обеспечение вирусологических исследований, производства и контроля иммунобиологических препаратов, выведение новых линий, чувствительных к вирусам, для производства вакцин.

И, наконец, коллекция перевиваемых соматических клеток сельскохозяйственных и промысловых животных во Всероссийском институте экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко РАСХН (руководитель - доктор биологических наук Лев Дьяконов). Здесь акцентируют внимание на кариотипировании*, методах диагностики "засорения" и "очистки" различных линий, получении новых гибридом.

Добавлю: многоплановая деятельность Коллекции была бы невозможна без системы информации и координации работы ее подразделений. Эту функцию выполняет созданная в 1991 г. Ассоциация специалистов по клеточным культурам в тесном сотрудничестве с Институтом цитологии РАН. Начиная с 1986 г. издано 23 выпуска информационного бюллетеня "Клеточные культуры". Создана база данных по линиям, имеющимся не только в фондах указанных институтов, но и в других научных учреждениях страны. В 1991 г. выпущен первый каталог клеточных линии отечественной коллекции, а спустя девять лет вышел в свет расширенный его вариант на русском и английском языках. Российская коллекция - член Всемирной федерации коллекции культур (сведения об имеющихся в нашем собрании гибридомах включены в международную базу данных), Европейской ассоциации аналогичного назначения.

Подчеркну: сохранение специализированных коллекций в научных учреждениях соответствующего профиля, располагающих высококвалифицированными специалистами в определенной области биологии, медицины и сельского хозяйства, позволило с самого начала не только поддерживать высокий профессиональный уровень работ, а и благодаря тесным связям с фундаментальной наукой вести поиск новых клеточных технологий.

Таким образом, длительная и чрезвычайно трудоемкая работа по созданию и развитию Коллекции оказалась своевременной, а ее актуальность состоит в поддержании независимости развития отечественных исследований и разработок критических технологий двойного назначения от аналогичных фондов других стран.

К великому сожалению, она до настоящего времени не обрела официального статуса национальной в собственной стране. Не имеет она также и постоянной целевой государственной финансовой поддержки, без чего вся огромная работа по расширению фондов и обеспечению стандартными клеточными линиями научных учреждений страны может остановиться. А ведь именно коллекционные фонды и составляют незаменимый фундамент, на котором в результате исследований поведения культивируемых клеток формируется наше понимание молекулярных механизмов, обеспечивающих жизнедеятельность организмов.

* Кариотипирование - определение типичной для вида совокупности морфологических признаков хромосом (прим. ред.).

Публикатор:

Постоянная ссылка для научных работ (для цитирования):

Комментарии: