Заглавие статьи | ФУНДАМЕНТ НАУКОЕМКИХ БИОТЕХНОЛОГИЙ |
Автор(ы) | Евгения СИДОРОВА |
Источник | Наука в России, № 3, 2008, C. 21-27 |
Евгения СИДОРОВА, журналист
Быстрое развитие современной биотехнологии предполагает постоянное обновление научных знаний о природных ферментах. Ведь точно предсказать течение катализируемых ими процессов, сделать происходящие превращения управляемыми и экономически привлекательными специалисты могут, лишь обладая подробными сведениями о свойствах этих удивительных веществ: структуре, функциональных качествах, активности в разных средах.
В лаборатории ферментативной модификации физиологически активных соединений Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова успешно проводят соответствующие исследования, по ряду направлений опережая зарубежных коллег.
Эта лаборатория входит в состав отдела биокинетики Института физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ и действует в контакте с факультетом биоинженерии и биоинформатики университета. А исторически она связана с химическим факультетом: ее коллектив продолжает исследования, начатые на кафедре химической энзимологии, созданной в 1974 г. членом-корреспондентом РАН Ильей Березиным. В середине 1960-х годов он увлекся ферментативным катализом и стал привлекать к работе по новой теме студентов. Ему помогали руководители небольших научных групп: Новелла Казанская, Валентин Лузиков (до конца жизни работавшие в МГУ), Карел Мартинек (сегодня академик Чешской АН), Наталья Угарова (доктор химических наук, сотрудник МГУ). С энтузиазмом, свойственным юности, они занялись изысканиями в области, изобилующей "белыми пятнами", и сумели сказать свое слово. Можно упомянуть открытие в середине 1970-х годов светочувствительных ферментативных реакций Сергеем Варфоломеевым* (с 2006 г. член-корреспондент РАН и директор Института биохимической физики им. Н. М. Эмануэля РАН), демонстрацию возможностей использования иммобилизо-
* См.: С. Варфоломеев. Молекулярный полиморфизм человека. - Наука в России, 2008, N 2 (прим. ред.).
ванных ферментов* в органических средах Александром Клибановым, впоследствии развившем данное направление в США (ныне член Национальной академии наук США, профессор Массачусетсского технологического института), изучение феномена мицеллярного катализа и мицеллярной энзимологии** Анатолием Яцимирским (ныне профессор Национального независимого университета Мехико) и Андреем Левашовым (доктор химических наук, профессор МГУ), исследование природы специфичности ферментов Анатолием Клесовым (ведущий ученый американской компании Про-Фармасьютикалс) и еще многие труды этих и других учеников Березина, работающих сегодня в России, а также в США, Германии, Швеции, Канаде, Франции, Мексике, Литве, Эстонии.
Доктор химических наук, профессор факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ Витас Швядас также из Березинского призыва. Он создал лабораторию ферментативной модификации физиологически активных соединений и, придерживаясь традиции, активно вовлекает в исследования талантливую молодежь - сегодня большинство его сотрудников моложе 35 лет.
В лаборатории три группы, работающие взаимосвязано, но ставящие перед собой разные задачи. Тематика первой, возглавляемой лауреатом премии Европейской академии для молодых ученых 2003 г., кандидатом химических наук Максимом Юшко, - использование ферментов для модификации (β-лактамных антибиотиков (т.е. пенициллинов и цефалоспоринов). Вторая под руководством кандидата химических наук Дорела Гуранды (удостоен премии Европейской академии для молодых ученых в 2006 г.) разрабатывает биокаталитические методы получения хиральных*** соединений, используемых в тонком химическом синтезе, производстве лекарственных препаратов и агрохимических средств. Задача третьей во главе с кандидатом химических наук Гермесом Чиловым - молекулярное моделирование ферментов, позволяющее на основе знания тонких деталей механизма их действия придать этим веществам нужные человеку свойства.
Основная цель указанных изысканий - получение биокатализаторов, которые превзойдут существующие в природе ферменты, и разработка методов их практического использования.
ОСНОВА ДЛЯ РАЗВИТИЯ
Из всех антибиотиков, применяемых в настоящее время, самые доступные и широко востребованные - пенициллины и цефалоспорины. 1 кг всем известного пенициллина на мировом рынке сегодня стоит примерно 20 дол. - довольно низкая цена, что в немалой степени связано с разработкой оптимальных биотехнологий его получения. Десятки тысяч тонн этого лекарства производят посредством фермента-
* Иммобилизованные ферменты - препараты ферментов, молекулы которых связаны с матрицей или носителем (как правило, полимером), сохраняя при этом свои каталитические свойства (прим. ред.).
** Мицеллярный катализ - моделирование ферментативной реакции с помощью мицелл детергентов. Мицеллярная энзимология занимается выяснением роли надмолекулярной организации ферментов в проявлении ими каталитической активности (прим. ред.).
*** Если молекулы какого-либо вещества, подобно "правым" и "левым" кристаллам (соответственно вращающим плоскость поляризации света в противоположных направлениях), являются зеркальным отражением друг друга, их называют хиральными. Это свойство возникает вследствие пространственной изомерии (стереоизомерии) молекул соединений, одинаковых по составу и молекулярной массе (прим. ред.).
ции. Однако с течением времени возникает потребность в увеличении специфичности и устойчивости действующего вещества. А проводить синтез чрезвычайно сложной структуры (β-лактамных антибиотиков химическими методами практически невозможно (только теоретически). Для получения более эффективных аналогов этого природного соединения, продуцируемого плесенью Penicillium chrysogenum, его надо расщепить на две части: одну (ацильную*) заменить, а другую - так называемое ядро пенициллина - оставить. И тут на помощь приходят ферменты.
Начиная с 1970-х годов сотрудники Института физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ совместно со специалистами из Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков (ныне Государственного научного центра по антибиотикам) и Таллинского политехнического института изучали процессы, протекающие в ходе ферментативного расщепления β-лактамных антибиотиков. Затем на Саранском и Рижском заводах медицинских препаратов внедрили промышленные технологии получения ядер пенициллинов и цефалоспоринов. В 1984 г. эта многолетняя работа была отмечена Государственной премией СССР. И уже тогда стало ясно: надо применять ферменты для превращения ядер в новые антибиотики.
Термодинамические и кинетические исследования ферментативного синтеза β-лактамных антибиотиков, проводимые в МГУ, отмечали в мировой литературе еще в конце 1980-х годов среди наиболее принципиальных достижений в этой области наряду с исследованиями японских авторов по поиску новых ферментов. Тогда же во ВНИИ антибиотиков создали высокоактивные формы иммобилизованной пенициллинацилазы, катализирующей процесс превращения ядер в новые антибиотики. Однако серьезного теоретического задела и конкурентоспособной технологии получения биокатализатора оказалось недостаточно для практической реализации задуманного. Дело в том, что отечественная промышленность не смогла ими воспользоваться: ее слабым местом было неумение синтезировать доноры ацильной части**, а экономические реалии не позволяли привлечь зарубежных партнеров. Интеграция с мировой наукой помогла бы решить проблему, но, к сожалению, по разным причинам время упустили: еще в начале 1990-х годов наша страна занимала второе место в мире по выпуску антибиотиков, сегодня же отрасль переживает не лучшие времена.
Тем не менее многие специалисты считают, что четкая государственная политика в этой области поможет нашей фармацевтической индустрии вернуть (хотя бы отчасти) утраченные позиции. Ведь производство лекарств - одно из наиболее перспективных и выгодных направлений развития экономики, построенной на знаниях. В стране сохранились квалифи-
* Ацильная группа - RCO, т.е. остаток органической кислоты (прим. ред.).
** Ацильные доноры - соединения (например, амиды или сложные эфиры D-фенилглицина или п-окси D-фенилглицина), которые "поставляют" нужный радикал для присоединения к ядрам пенициллинов и цефалоспоринов и позволяют получить новые антибиотики (прим. ред.).
цированные кадры, талантливая молодежь стремится получить образование в сфере естественных дисциплин, с большим увлечением занимается наукой.
"Конкурс на соответствующие факультеты университета с каждым годом растет, - сказал нам Швядас, - выпускники МГУ нарасхват в зарубежных компаниях и университетах, но подавляющее большинство никуда не уедет, если будет возможность работать дома. Талантливого молодого специалиста привлекают крупные проекты, сложные, масштабные задачи, перспективы роста. И, к счастью, начиная с 2005 г. тут наметился перелом: федеральные целевые программы Министерства образования и науки РФ принципиально меняют ситуацию. Технологии живых систем - один из приоритетов научно-технического развития России. Проекты, поддерживаемые Федеральным агентством по науке и инновациям, предоставляют финансовую возможность заняться разработкой наукоемких технологий на самом современном уровне: в МГУ за последние годы создана мощная экспериментальная база, приобретено уникальное оборудование. В декабре 2007 г. запущена первая очередь мощнейшего в России вычислительного центра".
Слабое же звено, по мнению ученого, - потребитель новых технологий. Действительно, малые наукоемкие компании еще не могут взять на себя крупное производство. Поэтому нужна стратегия развития отечественной фармацевтической промышленности на основе всестороннего анализа существующих возможностей. И симпозиум "Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств", проводимый по инициативе РАН, РАМН и РАСХН в начале 2008 г., очень своевременен.
В России есть все предпосылки для решения этих задач. Прежде всего страна обладает необходимыми высококвалифицированными кадрами. Важную роль в поиске новых лекарств играют методы их компьютерного дизайна, а отечественные школы теоретических химиков, биоинформатиков, математиков, программистов, физиков в этом отношении несомненно конкурентоспособны. Отечественные компании в области комбинаторного химического синтеза завоевали устойчивые позиции на мировом рынке. Что же касается высокопроизводительного современного оборудования, то его можно приобрести. Есть сырьевые и энергетические ресурсы. Имеется и положительный опыт решения смежных проблем: у нас создаются крупные библиотеки химических веществ, скрининг которых - важный этап поиска новых лекарственных препаратов.
Такой работой занимаются, например, в Исследовательском институте химического разнообразия (подмосковный город Химки). Синтезированные здесь сотни тысяч новых соединений представляют огромный интерес для фармацевтических компаний. Подобные коллекции сами по себе востребованы на рынке, однако их ценность будет во много раз больше, если удастся их "фокусировать", т.е. повысить эффективность взаимодействия с так называемыми фармацевтическими мишенями. Тогда стоимость кандидата в новые лекарства (его называют "лид") вырастает на несколько порядков. Ну а этапом, способным принести разработчику максимальный успех, становится дальнейшее совершенствование лида.
СИНТЕЗ НОВЫХ ВЕЩЕСТВ
Наряду с поиском новых лекарственных средств большой интерес у зарубежных коллег и коммерчес-
ких компаний вызывает разработка методов их синтеза. Упомянутая выше группа Максима Юшко - одна из мировых лидеров по эффективности предлагаемых методик получения новых (β-лактамных антибиотиков. Отличительная черта подходов, разрабатываемых этими и другими сотрудниками лаборатории Швядаса, в том, что биокаталитические процессы проводят в водной среде, где ферменты более стабильны и активны; подобные разработки привлекательны в экологическом отношении и с каждым годом становятся все востребованнее.
А ведь недавно основной тенденцией практического использования биокатализа была ориентация на ферментативный синтез в органических растворителях. И, наоборот, перспективы осуществления синтеза в воде считались сомнительными: ожидали, что в этих условиях в первую очередь будет протекать гидролиз. Как проводить ферментативный синтез в водной среде, насколько успешными могут быть такие процессы? Можно ли разобраться в сложной кинетике, управлять ею? В лаборатории справились с задачей, научились проводить ряд сложных реакций, в том числе превращать ядра антибиотиков в нужные продукты.
Плодотворные исследования проводит сегодня и группа Дорела Гуранды. Оптически активные соединения - важная составная часть многих физиологически активных веществ, в том числе антибиотиков, ряда лекарств и препаратов агрохимии. Но синтезировать их химическими методами крайне трудно. Зато обладающие высокой стереоселективностью ферменты могут с успехом справляться с этой проблемой. Что это значит? В свое время французский микробиолог и химик, член Парижской и почетный член Петербургской АН Луи Пастер (1822 - 1895) отделял энантиомеры* пинцетом, основываясь на форме кристаллов. Ныне выяснили: оптические изомеры химического вещества под действием ферментов превращаются с разными скоростями, на чем можно основывать методы получения соответствующих хиральных соединений.
"Мы стали использовать ферменты для получения так называемых энантиомерно чистых веществ. Это очень важное направление в фармакологии, поскольку часто только один из "оптических антиподов" обладает искомым терапевтическим эффектом, а другой способен вызывать и нежелательные. Как оказалось, для поставленной цели можно использовать то же самое семейство ферментов, что мы с успехом применяем для синтеза антибиотиков", - рассказал Швядас. Так в возглавляемой им лаборатории возникло еще одно перспективное направление. А Гуранда и его коллеги первыми в мире показали возможность ферментативного ацилирования** аминосоединений (в данном случае первичных аминов***) в водной среде и предложили метод получения энантиомерно чистых аминов, являющихся частью многих физиологически активных веществ. Их идеи защищены патентами.
НЕИЗВЕДАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ ФЕРМЕНТОВ
По мере того как специалисты лаборатории постигали механизм действия ферментов как катализаторов определенных химических реакций, им открывалось все больше возможностей по использованию этих удивительных веществ. Но для более глубокого понимания тонких деталей механизма их действия не хватает физических методов изучения. И выяснилось: представить стадии превращений, недоступные экспериментально, ученые могут с помощью молекулярного моделирования. Так возникла самая молодая исследовательская группа в лаборатории Швядаса.
"Если нас интересует структура фермента, - отметил ученый, - то прежде всего обращаемся к данным рентгеноструктурного анализа, для выполнения которого надо вырастить кристаллы изучаемого вещества. Но исследователя в большей степени интересует не структура самого фермента, а строение фермент-субстратного комплекса**** и каталитические события, происходящие после связывания субстрата. К сожалению, постичь их сущность, апеллируя лишь к результатам упомянутого анализа, практически невозможно: комплекс фермента с субстратом быстро превращается и экспериментальные методы не "улавливают" его структуру. Чтобы приблизиться к разгадке, надо идти на "хитрости": инактивировать фермент либо применять не подверженные превращениям аналоги вещества, к которому он проявляет специфичность. В обоих случаях приходится имитировать реакцию, заведомо идя на потери важных деталей".
Чтобы важные моменты не ускользнули из поля зрения исследователя, он может прибегнуть к молекулярному моделированию происходящих процессов, используя методы теоретической химии, молекулярной динамики, а также так называемые гибридные. Сопоставление результатов расчетов и эксперимента позволяет подтвердить или опровергнуть возникающие предположения. Каким образом?
* Энантиомеры, или оптические изомеры - пары веществ, характеризующихся противоположными по знаку и одинаковыми по величине вращениями плоскости поляризации света при идентичности всех других физических и химических свойств (прим. ред.).
** Ацилирование - введение ацильной группы в молекулу органического соединения (прим. ред.).
*** Амины - производные аммиака, атомы водорода в которых замещены на органические остатки (R). В зависимости от числа последних амины делят на первичные (RNH2), вторичные и третичные (прим. ред.).
**** Одним из механизмов, обусловливающих каталитическое действие фермента по отношению к определенному веществу (субстрату), является связывание субстрата ферментом и образование обратимо диссоциирующего фермент-субстратного комплекса (прим. ред.).
Продуктивное связывание пенициллина в активном центре пенициллинацилазы, установленное при помощи молекулярного моделирования. Красным цветом в структуре пенициллина обозначены атомы кислорода, синим - азота, желтым - серы, голубым - углерода. Поверхность фермента окрашена в зависимости от полярности участка.
Ученые знают многие функциональные свойства ферментов и пытаются понять, как они связаны со структурными изменениями в ходе превращений. Сопоставляют факты, рассчитанные параметры, устанавливают степень адекватности построенной ими теоретической модели, делают предсказания и проверяют их экспериментально. Чем критичнее исследователь относится к полученным результатам, тем более глубокого понимания механизма действия фермента ему удается достичь.
Сегодня в лаборатории накоплена огромная экспериментальная база. Руководитель приводит характерный пример, подтверждающий эффективность моделирования, подкрепленного натурными исследованиями. Более 10 лет назад он и его коллеги теоретически обосновали, как организован активный центр одного из ферментов, и не сомневались: здесь важную роль играет положительный заряд. Каково же было их недоумение, когда рентгенологи, впервые определив структуру фермента, ответили, что положительно заряженного остатка в его активном центре нет. Это, однако, не поколебало уверенности университетских специалистов. И подтверждение пришло спустя несколько лет: при рентгеноструктурном анализе, наконец, "увидели", что положительный центр существует, и хотя находится на расстоянии, но выполняет свою роль через мостиковые молекулы воды. Молекулярное моделирование дало более глубокое понимание этих взаимодействий.
Теперь Швядас с сотрудниками стараются выяснить, как следует изменить структуру фермента, чтобы полученный в лаборатории биокатализатор работал лучше природного. Опыты свидетельствуют: активность фермента по отношению к некоторым субстратам может быть увеличена, однако надо научиться повышать эффективность превращений, важных для конкретного практического использования. Вначале нужно добиться улучшения виртуальных (оцениваемых в компьютерном эксперименте) свойств, затем, будучи уверенными, что рекомендации, полученные на первом этапе, верны, дать заказ специалистам по генной инженерии.
Ученые убеждены: ферменты можно использовать не только для проведения тех превращений, что осуществляются ими в природе. Так, в лаборатории чрезвычайно высокая активность пенициллинацилазы (ответственной за модификацию природного пенициллина) обнаружена в химической реакции, не встречающейся в естественных системах. Более того, названный белок показал здесь в качестве катализатора свой "лучший результат". Так не слишком ли скромны бытующие представления о перспективах использования ферментов в химическом синтезе? По мнению Швядаса, потенциал биокатализа еще неизведан и, по-видимому, огромен. Если уже существующие ферменты способны удивлять экспериментаторов, то какие же возможности таит их целенаправленная модификация!
Сегодня энзимологи обсуждают вопрос: нельзя ли осуществить дизайн фермента, катализирующего реакцию, пока неизвестную в химии. И университетским специалистам такая задача уже не кажется фантастикой: "если до сих пор мы оптимизировали ферменты для более эффективного проведения природных превращений, то теперь нужно начинать создавать их по потребности человека". За последние годы исследователи разобрались, как работать с этими сложными веществами, моделировать протекание реакций с их участием, предсказывать свойства и добиваться целенаправленного их изменения путем модификации структуры.
ПЕРСПЕКТИВЫ
При решении задач, связанных с дизайном биокатализаторов, чрезвычайно полезными окажутся методы биоинженерии и биоинформатики. Ведь существуют два направления изысканий: преобразование (инженерия) белка и выявление новых для человека природных ферментов*. До сих пор ферменты изучали главным образом как компоненты живых систем, пытаясь понять, как они работают в естественной среде. Теперь же ученые в большей степени ставят вопрос об их использовании в практических целях,
* См.: А. Синицын. Универсальные ферменты. - Наука в России, 2007, N 4 (прим. ред.).
Структура гетеродимера пенициллинацилазы по данным рентгеноструктурного анализа.
целенаправленно меняют структуру белка, заставляют ферменты взаимодействовать с новым кругом химических соединений, работать с максимально возможными количествами исходных компонентов, функционировать в непривычных условиях. "И оказывается, - отметил Швядас, - способности этих веществ выходят далеко за рамки "химии жизни". Дальнейшее их познание предполагает более широкое исследование феномена биокатализа. Тут огромная перспектива для молекулярного моделирования. Быстро развивающиеся вычислительные ресурсы способны сыграть большую роль в изучении и использовании биологических систем". В настоящее время возглавляемая им лаборатория активно сотрудничает с вычислительным центром МГУ.
Вслед за Пастером, утверждавшим, что не знает прикладной науки, ибо наука и области ее применения "связаны друг с другом, как плод с взрастившим его деревом" (Ревью Сайентифик, 1871 г.), руководитель университетской лаборатории считает: лишь фундаментальные исследования способны породить конкурентоспособные технологии. И наоборот - решение сложных практических задач позволяет обнаружить теоретические проблемы. "Наш единственный нобелевский лауреат по химии - создатель отечественной школы химической кинетики* - дал нам многочисленные примеры этой неразрывной взаимосвязи. Сегодня основа развития биоинженерии и биотехнологии - богатые знания, накопленные в разных областях: химии и физике белка и нуклеиновых кислот, биохимии, молекулярной и клеточной биологии, биоинформатике, микробиологии, химической кинетике и химической технологии. Важно также уметь творчески применять новейшие вычислительные технологии, математическое и молекулярное моделирование биологических систем", - подчеркнул ученый.
* В 1956 г. Нобелевская премия по химии была присуждена академику Николаю Семенову (1896 - 1986) за исследования механизма химических реакций (прим. ред.).
New publications: |
Popular with readers: |
News from other countries: |
![]() |
Editorial Contacts |
About · News · For Advertisers |
![]() 2009-2025, ELIBRARY.COM.UA is a part of Libmonster, international library network (open map) Keeping the heritage of Ukraine |