Доктор биологических наук Елизавета БОНЧ-ОСМОЛОВСКАЯ, заместитель директора по научной работе, заведующая лабораторией гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН

Термофильные микроорганизмы (буквально - "любящие тепло") известны уже более ста лет, однако активно их изучают в последние несколько десятилетий. Предпочитая развиваться при высоких температурах, они принадлежат к группам наиболее древних на Земле; их сообщества рассматриваются как аналоги экосистем, существовавших на заре возникновения жизни. Продуцируемые этими микроорганизмами ферменты необычайно термостабильны, что привлекательно для биотехнологии.

КАЛЬДЕРА УЗОН-МУЗЕЙ МИКРОБОВ

Долгое время считалось, что термофильные прокариоты не могут развиваться при температурах выше 50 - 60°C. Однако за последнюю четверть XX в. наши знания о них претерпели существенные изменения. Истинный переворот совершил американский микробиолог Томас Брок, который начал исследовать горячие источники вулканического происхождения. Как оказалось, там обитают микроорганизмы, способные расти при 60 - 80°С. Позднее немецкие ученые Вольфрам Циллиг и Карл Штеттер открыли гипертермофилы, оптимально растущие при температуре выше 80°C. В настоящее время верхний температурный предел развития живых существ составляет около 122°C. Он достигается в глубинных морских горячих источниках, где перегретый водяной пар остается жидким за счет повышенного гидростатического давления. В нашем институте, с 2003 г. носящем имя одного из основоположников отечественной микробиологии Сергея Виноградского, исследования термофильных микроорганизмов, обитающих в горячих ис-

точниках вулканического происхождения, были начаты почти одновременно с первыми разработками западных коллег в этой области - в конце 1970-х годов. Основным полигоном изысканий была и остается по сей день кальдера* вулкана Узон (Кроноикий заповедник, Камчатка)**, где сотни горячих источников с разнообразнейшими характеристиками (в первую очередь это касается температуры и кислотности среды) служат местами обитания самых разных термофилов.

В здешних источниках с умеренными температурами 50 - 70°C развиваются микробные сообщества, так называемые "маты", состоящие из цианобактерий - фотосинтезирующих прокариот и сопутствующих им многочисленных органотрофных бактерий (организмов, использующих вещество фотосинтетиков). Заведующий лабораторией реликтовых микробных сообществ нашего института академик Георгий Заварзин с сотрудниками в 1980 г. выдвинул гипотезу о ведущей роли цианобактериальных сообществ в создании современной атмосферы Земли: действительно, им удалось показать, что "маты" в считанные дни преобразуют поступающие в источник вулканические газы в атмосферу, сходную с современной.

Однако в более древние периоды истории Земли жесткое ультрафиолетовое излучение делало невозможным присутствие жизни на освещенной поверхности. Поэтому аналогами древнейших экосистем, как уже сказано, могут служить современные термофильные микробные сообщества, существующие за счет неорганических источников энергии вулканического происхождения, причем в отсутствие кислорода. Так, из высокотемпературных источников кальдеры Узон доктор биологических наук Маргарита Мирошниченко выделила организмы, растущие при температуре 75 - 80°C, синтезирующие органическое вещество из CO₂ и использующие при этом энергию молекулярного водорода - литоавтотрофы (дословно: "питающиеся камнями", т.е. неорганическими соединениями). Они оказались так называемыми строгими анаэробами - не только не нуждаются в кислороде, но даже не растут в его присутствии. Однако для любой реакции, дающей энергию для жизнедеятельности, необходим и окисляемый высокоэнергизованный субстрат, и окислитель. В данном случае речь идет о разнообразных соединениях серы, также в изобилии присутствующих в горячих источниках.

К органическому веществу в кальдере Узон, образуемому фотосинтезирующими и литоавтотрофными микроорганизмами, добавляется растительная органика из окружающих низкотемпературных зон. Все эти компоненты интенсивно разлагаются органотрофными термофилами, как бактериями, так и археями (группа наиболее древних прокариот). Среди последних немало гипертермофилов с оптимальной температурой роста выше 80°C. Например, выделенный кандидатом биологических наук Ильей Кублановым Desulfurococcus kamchatkens способен разлагать белки, включая такие труднодоступные, как альфа-кератин (он является основой волос и шерсти у млекопитающих). У этого организма температурный оптимум рос-

* Кальдера - котлообразная впадина с крутыми склонами и ровным дном, образовавшаяся вследствие провала вершины вулкана, а иногда и прилегающей к нему местности; в диаметре достигает 10 - 15 км и более (прим. ред.).

** См.: В. Иванченко. Жемчужина Камчатки. - Наука в России, 1991, N А (прим. ред.).

Новые термофильные микроорганизмы из кальдеры Узон: литоавтотрофная бактерия Caldimicrobium rimae (a) и органотрофная архея Fervidococcus fontis (b).

та - 85°C, верхний же предел - 92°C. Другой представитель подобных архей - Acidilobus saccharovorans, обнаруженный кандидатом биологических наук Марией Прокофьевой, растет и при 98°C, да еще в кислых условиях (pH - оптимум роста 3,8). Он способен разлагать большое количество Сахаров и полисахаридов, вроде крахмала.

Одно из достижений современной микробиологии - возможность оценивать микробное разнообразие путем прямого анализа ДНК, выделенной непосредственно из природной пробы. При этом идентифицируются не только уже известные микроорганизмы, но и новые, еще не полученные в лабораторных культурах. Например, кандидат биологических наук Анна Перевалова обнаружила на Узоне группу термофильных архей, ранее считавшихся некультивируемыми, а затем получила их первого культивируемого представителя - Fervidococcus fontis.

Присутствие микроорганизмов, осуществляющих определенные биогеохимические процессы, можно выявить, анализируя в образцах природной ДНК соответствующие функциональные гены. Именно так кандидат биологических наук Николай Черных детектировал группы термофильных бактерий, продуцирующих органическое вещество из CO₂ в наиболее горячих источниках кальдеры Узон, а аспирант нашей лаборатории Александр Меркель обнаружил новых термофилов, образующих метан. Эти сведения ценны и сами по себе, и как руководство к дальнейшему поиску микроорганизмов культуральными методами.

НА ДНЕ ОКЕАНА

Горячие источники вулканического происхождения существуют не только на поверхности Земли, но и под водой, в том числе на больших глубинах. Уникальные ассоциированные с ними экосистемы открыл американский исследователь Хольгер Яннаш с сотрудниками вначале 1980-хгодов. Микроорганизмы, обитающие в глубоководных гидротермах и вокруг них, как мезофильные*, так и термофильные, используют неорганические субстраты вулканического происхождения, синтезируя из углекислоты органическое вещество, последнее служит пищей для разнообразных беспозвоночных животных. Глубоководные гидротермы стали источником большого числа новых термофильных и гипертермофильных микроорганизмов, выделенных, в том числе, сотрудниками нашего института. Многие из полученных изолятов - литотрофы, использующие неорганические источники энергии. Речь идет о Caldithrix abyssi, выделенном Маргаритой Мирошниченко. Он использует молекулярный водород; причем окислителем служит нитрат, восстанавливающийся в аммоний. Удивительная особенность Caldithrix - отсутствие родственных форм среди всех ранее известных бактерий: он образует отдельную ветвь на филогенетическом древе. Возможно, дальнейшие исследования расширят представления об этой группе микробов.

* Мезофилы - организмы, нормально существующие и размножающиеся при температурах 20 - 40°C (прим. ред.).

Организмы семейства Thermaceae были в числе первых термофилов, когда-то обнаруженных Томасом Броком в Йеллоустоунском национальном парке (США). Затем выяснилось: представители рода Thermus широко распространены в наземных гидротермах всего земного шара; они растут за счет окисления разнообразных органических субстратов кислородом воздуха. Мы обнаружили родственные им организмы в глубоководных гидротермах Тихого и Атлантического океанов, однако они оказались совершенно особенными. Во-первых, хотя и растут аэробно, но лишь при низких концентрациях кислорода, являясь так называемыми микроаэрофилами. Во-вторых, в отличие от наземных Thermaceae, глубоководные "особи" способны к литотрофному росту с молекулярным водородом - и в микроаэрофильных условиях, и с нитратом в качестве окислителя; в последнем случае продуктом его восстановления является нитрит.

Словом, и в наземных, и в морских гидротермах обитают термофильные бактерии и археи, использующие молекулярный водород как субстрат, а разнообразные неорганические вещества как окислители при анаэробном дыхании. Причем круг известных специалистам реакций, используемых термофилами в качестве энергодающих процессов, постоянно расширяется. Две группы таких микроорганизмов, открытые под руководством Георгия Заварзина, сейчас активно исследуют в нашей лаборатории, поэтому на них остановимся подробнее.

ВКУСНАЯ ОКИСЬ УГЛЕРОДА

Окись углерода, как и водород, входит в состав вулканических газов, поступающих в гидротермы. Способность к использованию соединения, являющегося ядом для большинства живых существ, как оказалось, широко распространена среди термофилов. Причем CO они "перерабатывают" анаэробно, т.е. окисляют в CO₂ без участия кислорода. Второй продукт жизнедеятельности - водород - образуется из воды: CO+H₂O = CO₂+H₂.

Этот процесс получил название гидрогеногенной карбоксидотрофии, и первый осуществляющий его термофил был выделен кандидатом биологических наук Виталием Светличным в 1990 г. За прошедшие два десятилетия усилиями доктора биологических наук Татьяны Соколовой и ее учеников сведения о данных организмах существенно расширены. Они обнаружены как в наземных, так и морских глубоководных гидротермах; среди них есть представители многих родов бактерий, а также гипертермофильные археи. Первые выделенные нами гидрогеногенные карбоксидотрофы росли в атмосфере 100%-ной окиси углерода. Однако когда кандидат биологических наук Татьяна Кочеткова снизила начальную концентрацию CO до 45, а потом и до 15%, их разнообразие заметно выросло. Учитывая же, что природные концентрации окиси углерода в горячих источниках чаще всего составляют доли процентов, это разнообразие может оказаться значительно шире, ибо способность использовать окись углерода как энергетический субстрат может сочетаться с чувствительностью к его высоким концентрациям.

Отметим: термофильные гидрогеногенные карбоксидотрофы не составляют единой филогенетической группы и принадлежат к разным родам, ветвям и даже доменам (археи и бактерии) на древе прокариот. Проведенное кандидатом биологических наук Александром Лебединским исследование генетического аппарата гидрогеногенной карбоксидотрофии показало: обусловливающие этот процесс CO-дегидрогеназный и гидрогеназный комплексы у разных мироорганизмов организованы однотипно. Можно предположить, что широкое распространение этого свойства у термофилов в целом связано с переносом соответствующего кластера генов от одной группы к другой, благодаря чему они приобрели дополнительную возможность существования в гидротермах в условиях недостатка органического вещества.

ОНИ НЕ ТОЛЬКО ВОССТАНАВЛИВАЮТ МЕТАЛЛЫ

В процессе анаэробного дыхания термофильные микроорганизмы способны восстанавливать различные металлы с переменной валентностью, скажем, железо. Так, представителя гипертермофильных археи Geoglobus acetivorans, у которого рост обеспечивается за счет окисления молекулярного водорода и одновременного восстановления оксида железа, выделила сотрудник нашей лаборатории Галина Слободкина из наиболее глубоко расположенных (при-

Новые термофильные микроорганизмы из глубоководных гидротерм - Caldithrixabyss's (a) и Oceanithermus profundus (b).

мерно 4000 м от поверхности океана) гидротерм Срединно-атлантического хребта - поля Ашадзе.

Кстати, эту способность термофильных микроорганизмов можно использовать в технологиях очистки промышленных стоков от токсичных металлов или радионуклидов. Дело в том, что растворимость восстановленных форм многих металлов значительно ниже, чем окисленных, поэтому в ходе указанного процесса первые будут эффективно удалены из раствора в осадок. Доктор биологических наук Александр Слободкин с сотрудниками продемонстрировали способность термофильных прокариот эффективно выводить из раствора соединения хрома, урана, технеция.

Выявлено, что микроорганизмы вступают во взаимодействие и с нерастворимыми веществами, применяя при этом различные стратегии. Как определил кандидат биологических наук Сергей Гаврилов, если оксид железа, выступающий в роли акцептора электронов, заключить в пористые оболочки, то микроорганизмы контактируют с ним с помощью специальных поверхностных структур - пилей, проникающих в поры. В настоящее время этот механизм интенсивно изучают, ибо пили - природные проводники электронов, т.е. электрического тока.

Еще один интересный аспект изучения восстановления термофильными микроорганизмами нерастворимых акцепторов - способность в экспериментальной электрической сети переносить электроны на один из электродов - анод. Так можно создать "микробный топливный элемент", в нем освобождающаяся энергия химических связей будет превращаться в электрическую.

ОБИТАТЕЛИ ПОДЗЕМНОГО ЦАРСТВА

Все микроорганизмы, о которых шла речь, обитают в горячих источниках или гидротермах - наземных или морских. Но есть еще одно местообитание, значительно менее доступное, однако не сравнимое с гидротермами по масштабу. На глубине 1500 - 3000 м от поверхности Земли температура начинает повышаться до 60 - 80°C и более, однако эти условия вполне комфортны для высокотемпературной подземной биосферы.

Например, из пластовых вод Самотлорского нефтяного месторождения (Западная Сибирь) Маргарита Мирошниченко выделила гипертермофильные археи и бактерии, как ни странно, близкородственные аналогичным организмам, обнаруживаемым в морских гидротермах. Аборигенное происхождение этих изолятов не вызывает сомнения, поскольку скважина, где их обнаружили, никогда не заполнялась водой для увеличения давления нефти. Один из них, представитель широко распространенных в морских гидротермах гипертермофильных архей рода Thermococcus, был назван нами Thermococcus sibiricus - по месту выделения, на тысячи километров удаленному и от морей, и от вулканических горячих источников. Юрские отложения, в пластовых водах которых обитает данный организм, - это осадки древнего моря, а пластовая вода по химическому составу близка к морской. Температура, на глубине 1800 м достигавшая 84°C, оптимальна для микроорганизмов этого рода. Последующие исследования других ученых показали: археи, относящиеся к открытому нами виду, обнаруживаются также в образцах из нефтяных скважин Китая и Японии. Отсюда следует, что им заселена высокотемпературная подземная гидросфера обширного ареала.

ТЕРМОСТАБИЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ

Основа практического интереса к термофилам - их ферменты. Ферменты микроорганизмов широко используются в самых различных областях деятельнос-

ти человека: производстве моющих средств, пищевых продуктов, кормов, в целлюлозно-бумажной и текстильной промышленности, переработке различных отходов. Если ферментативная реакция идет при высокой температуре, то ее скорость возрастает, а опасность заражения посторонними микроорганизмами резко снижается. К тому же стойкость по отношению к высокой температуре связана с устойчивостью и к другим факторам, скажем, к детергентам, что важно, например, при использовании термостабильных гидролитических ферментов в моющих средствах. Не случайно потребности промышленности в таких ферментах стимулировали исследования разнообразия термофильных микроорганизмов.

Один из примеров подобного поиска - обнаружение кератиназы Caldoanaerobactev 1004 Ильей Кублановым. Продуцирующий этот фермент организм выделен из горячего источника в окрестностях озера Байкал (долина реки Баргузин) и способен к росту на альфа- и бета-кератинах - белках шерсти животных и перьев птиц. Выделяемая им внеклеточная кератиназа вызывает гидролиз кератинов, устойчивых к действию обычных протеиназ. Этот фермент можно применять для переработки отходов животноводства, особенно птицеводства, так как перья разлагаются крайне медленно и их переработка составляет большую проблему.

ГЕНОМЫ ТЕРМОФИЛОВ - БАНКИ ЦЕННЕЙШИХ ГЕНОВ

С точки зрения практического применения недостаток термофильных микроорганизмов - их слабый рост в лабораторных условиях. Время одного клеточного деления может составлять всего 30 мин, но обычно масса клеток не достигает большой плотности из-за относительно небольшого выхода осуществляемых ими процессов (в большинстве своем анаэробных). Поэтому для получения нужного количества требуемого фермента необходимо клонировать кодирующий его ген и затем экспрессировать - тогда рекомбинантный штамм наработает значительный объем необходимого белка. Для этого нужно выяснить строение искомого гена, а это трудная задача, включающая полную очистку и определение аминокислотной последовательности белка, что опять же упирается в слабый рост исходного микроорганизма при лабораторном культивировании.

Указанные проблемы решать легче, если получить полную геномную последовательность изучаемого организма, а затем с помощью биоинформационных методов найти гены, кодирующие ценные для биотехнологии ферменты. Кстати, в развитых странах поиск полных геномных последовательностей различных микроорганизмов, в том числе и термофильных, ведут уже давно, а в России долгое время этим вопросом не занимались.

Ситуация изменилась за последние два года, когда в Центре "Биоинженерия" РАН с нашим участием и при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации было определено 12 полных последовательностей геномов выделенных нами термофильных микроорганизмов (11 архей и одной бактерии). Уже закончен анализ трех из них, остальные находятся на разных стадиях изучения. Все три исследованных организма - гипертермофильные археи Desulfurococcus kamchatkensis, Thermococcus sibiricus и Acidilobus saccharovorans - растут при температуре 85 - 88°C. В их геномах обнаружены новые гидролитические ферменты. У Desulfurococcus kamchatkensis это ряд протеиназ с различным молекулярным весом,

Гидрогеногеннаякарбоксидотрофная термофильная бактерия Thermincola carboxidiphilum.

а также амилазы. Очень много сюрпризов преподнес Thermococcus sibiricus: описанный как использующий в своем развитии только пептиды, он оказался носителем ряда генов, вызывающих гидролиз разнообразных полисахаридов. В геноме они образуют единый кластер - "полисахаридный остров", что, видимо, позволяет организму существовать в отложениях юрского периода за счет разложения захороненной органики бывшего моря. У Acidilobus saccharovorans в дополнение к генам, кодирующим ферменты, осуществляющие гидролиз полисахаридов, выявили набор других, обеспечивающих гидролиз жиров и их окисление. Стало также понятно, что данная архея осуществляет полное окисление органического вещества; акцепторами электронов при этом служат соединения серы.

Таким образом, информация о полном наборе генов, имеющихся у микроорганизма, открывает доступ к кодирующим важные для биотехнологии термостабильные ферменты. При этом их круг оказывается значительно шире, чем можно было предположить, исходя из возможностей лабораторного культивирования. Одновременно выявляются новые детали метаболизма, в том числе проясняющие эволюцию той или иной группы, место исследуемого микроба в современных сообществах гидротерм.

В заключение хотелось бы отметить: в последнее десятилетие существенно сокращено отставание отечественной науки в области молекулярной микробиологии. К сожалению, в прорыве, совершенном мировым научным сообществом в 1990-е годы с помощью молекулярно-биологических методов, мы практически не участвовали, а ведь именно эти подходы поставили изучение экологии и разнообразия микроорганизмов на совершенно новый уровень. Однако затем ситуация в стране стала меняться. Во многом благодаря реализации программы Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология", руководимой академиком Георгием Георгиевым. Начатая в 2002 г. в виде открытого и прозрачного конкурса, она обеспечила лучшим лабораториям возможность работы на современном уровне. Наш коллектив оказался в их числе, и за прошедшие семь лет мы значительно продвинулись в применении молекулярно-биологических методов к изучению микробных сообществ вулканических местообитаний. Сочетание новых подходов с сохранившимся в России искусством культивирования микроорганизмов, обладающих уникальными типами метаболизма, принесло результаты: нам удается не только детектировать новые группы термофильных микробов, но и получить их в лаборатории. Это, в свою очередь, позволяет оценить свойства и, следовательно, роль в природных экосистемах. Дополнением к традиционным культуральным подходам стали данные геномики - они существенно расширили, а иногда и перевернули предшествующие представления о свойствах исследуемого организма.

Работы лаборатории гипертермофильных микробных сообществ поддержаны грантами РФФИ: 06 - 04 - 49045, 09 - 04 - 00251, 09 - 04 - 49045.

Publisher:

Permanent link for scientific papers (for citations):

Comments: