Автор: С. А. ЛАПА, Д. А. ГРЯДУНОВ

Благодаря миниатюрным размерам и широким возможностям обработки информации биологические микрочипы находят все большее применение в медицинской диагностике. В их конструкции использована способность природных молекул, входящих в состав всего живого, специфично взаимодействовать друг с другом по принципу "ключ-замок", образуя пары рецептор-лиганд, антиген-антитело, гибриды ДНК-ДНК и т. д. Это свойство, наряду с возможностью параллельного анализа десятков и даже сотен объектов, определяет перспективность новой российской технологии.

стр. 33

Кандидаты биологических наук С. А. ЛАПА, Д. А. ГРЯДУНОВ, Центр биологических микрочипов Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Биологический микрочип - упорядоченная матрица отдельных микроскопических ячеек, и любая из них содержит индивидуальный зонд; в качестве последнего используют нуклеиновые кислоты, белки и даже живые клетки. И каждая ячейка - аналог реакционной пробирки, которых могут быть сотни и даже тысячи, что позволяет осуществлять одновременный множественный анализ биологических объектов, подобно тому, как электронный микрочип обрабатывает одновременно огромные массивы данных. И все это при минимальных размерах: в зависимости от типа биочипа диаметр его ячейки варьирует от 80 до 300 мк. Подложкой могут служить стандартное предметное стекло, а также пластик, силикон и т. д., что делает процедуру анализа удобной для пользователя. Современная робототехника позволяет производить в автоматическом режиме сотни соответствующих матриц в день, причем скорость их выпуска постоянно растет. Совокупность уникальных показателей - универсальность, миниатюрность, высокая чувствительность анализа, простота и дешевизна изготовления - способствует востребованности нового способа медицинской диагностики.

Технология биологических микрочипов развивается в Институте молекулярной биологии РАН с 1988 г. Основоположником и идейным вдохновителем этого направления стал наш бывший директор, академик А. Д. Мирзабеков (1937 - 2003). И уже на начальных стадиях разработки были приняты ключевые оригинальные решения, до сих пор выгодно отличающие российский подход от зарубежных аналогов*. Например, принципиальным явилось использование гидрогеля для формирования ячеек; это приводит к фиксации содержащихся в них молекулярных зондов в трехмерной структуре, т. е. в объеме, а не на плоскости, что до сих пор практикуют за рубежом. Кроме того, благодаря большей плотности зондов мы увеличили чувствительность метода. Наконец, закономерности процессов в трехмерной структуре гораздо ближе к таковым в растворе, что упрощает разработку тест-систем, открывает возможность изучать кинетику и термодинамику реакций в отдельных ячейках.

Дальнейшее совершенствование технологии биочипов привело к появлению в нашем институте упрощенной двухстадийной схемы их производства вместо прежней четырехстадийной. Теперь на первой стадии специальный высокоточный робот забирает из планшета заранее приготовленные смеси реагентов для формирования ячеек и переносит их на стеклянную подложку. Но по окончании данной операции микрокапли, содержащие компоненты геля, как и зонды, еще не имеют ковалентных связей между собой и не закреплены на подложке. На второй стадии, при облучении ультрафиолетом, инициирующим полимеризацию компонентов микрокапель, образуются стабильные гелевые ячейки. Теперь биочип готов к использованию.

Изначально разработка биочипов была ориентирована на расшифровку генома человека методом секвенирования путем гибридизации с библиотекой ДНК-зондов (олигонуклеотидов). На матрице фиксировали полный набор гексануклеотидов (синтетических фрагментов ДНК, состоящих из шести нуклеиновых оснований) всех возможных последовательностей, т. е. 4096 (или 4, где 4 - число оснований, встречающихся в природной ДНК, а 6 - число мономеров в составе синтетического зонда). Поскольку исследуемый фрагмент способен вступать в реакцию только с комплементарными гексамерами, чей порядок нуклеотидов соответствует изучаемому образцу, то становится возможной идентификация конкретной нуклеиновой кислоты. Такие биочипы названы генерическими (от англ. generic - общий), что отражает их универсальный характер.

Когда же требуется выяснить наследственные факторы предрасположенности людей к возникновению злокачественных опухолей, причины устойчивости патогенных микроорганизмов к антибиотикам, либо установить присутствие в образце определенной нуклеиновой кислоты (скажем, при диагностике инфекционных заболеваний), то чаще применяют специализированные олигонуклеотидные биочипы. В их ячейках содержится ограниченный набор высокоспецифичных ДНК-зондов, каждый из которых способен выявлять в образце нуклеиновую кислоту лишь данной последовательности. Они наиболее пригодны для решения медицинских задач.

Один из весьма удачных примеров применения ДНК-биочипов в диагностике - обнаружение с их помощью устойчивых к лекарственным средствам штаммов возбудителя туберкулеза человека - M. Tuberculosis. По статистике от этого недуга умирает каждый сотый в мире, и число новых случаев ежегодно растет. Создавшаяся тревожная ситуация во многом обусловлена распространением устойчивых к лекарственным средствам форм этого опасного возбудителя, причем противостоять ему бессильны даже самые эффективные химиопрепараты - рифампицин и изониазид. При этом по сей день повсеместно используют так называемый культуральный метод определения лекарственной чувствительности. Заключается он в посеве клини-

* См.: А. Д. Мирзабеков. Биологические микрочипы. - Наука в России, 2003, N 2 (прим. ред.).

стр. 34

Основные компоненты комплексной системы анализа с помощью биологических микрочипов: I - предварительная обработка анализируемой пробы; II - биочип, состоящий из гелевых ячеек (от 10 до 4096), содержащих различные зонды (фрагменты ДНК, белки, клетки); III - анализатор флуоресцентных изображений биочипов со специализированным программным обеспечением; IV- взаимодействие анализируемой пробы с зондами биочипа по принципу "ключ-замок" и электронное изображение флуоресценции; V-спектр основных диагностических задач, решаемых с помощью биочипов.

стр. 35

Биочип для обнаружения возбудителей особо опасных инфекций: I - схема биочипа; цветом выделены группы ячеек, специфичные к различным возбудителям; II - изображение, возникающее на биочипе при обнаружении сибирской язвы; III - идентификация вирулентного штамма возбудителя чумы; IV - флуоресцентное изображение, характерное для вакцинного штамма бруцеллеза.

ческого образца на специфических средах, содержащих противотуберкулезные компоненты. Если возбудители болезни активизируются, значит, они устойчивы к данному лекарству. Но растут они очень медленно, до получения результата может пройти несколько месяцев. И все это время пациентов лечат препаратами, которые на самом деле могут оказаться неэффективными, что приводит к неблагоприятной динамике заболевания и заражению других людей устойчивыми к лекарствам формами туберкулеза. Вот почему необходимо применять способы более быстрой диагностики.

Тут-то на помощь медицине и приходит биология. Так, молекулярно-генетические исследования позволили установить: невосприимчивость к большинству противотуберкулезных средств кодируется на генетическом уровне и возникает из-за появления в бактериальном геноме определенных мутаций. При лечении антибиотиками модифицированные клетки размножаются гораздо интенсивнее своих собратьев и постепенно накапливаются в организме. Выходит, химиотерапия неизбежно способствует селекции бактериальных клеток.

Указанные методы помогают установить типы мутаций, приводящих к лекарственной устойчивости, а технология биочипов - создать тест-системы, способные в кратчайшие сроки данные мутации обнаружить и, соответственно, ответить на вопрос об индифферентности возбудителя к лекарству. Речь идет об исследовании уже на генетическом уровне. Для этого на биочипе закрепляют набор специфичных ДНК-зондов, каждый из которых способен избирательно взаимодействовать лишь с одним типом бактериальной ДНК. По тому, какие из зондов вступили в реакцию, делается вывод, есть ли в этой ДНК мутации. Такой анализ можно выполнить за рабочий день, что в 30 - 60 раз быстрее, чем при классическом культуральном. И столь своевременная корректировка стратегии лечения существенно повышает шансы больных на выздоровление. Предложенный метод выявления лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза ныне успешно освоен рядом медицинских учреждений как в нашей стране, так и за рубежом. В перспективе - разработка биочипа, позволяющего, помимо рифампицина и изониазида, определять устойчивость микобактерий и к другим препаратам.

Описанные специфические мутации характерны не только для бактерий, но и для вирусов. В том числе и для вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вызывающего столь опасное заболевание, как СПИД. На сегодняшний день не известно ни одно средство, применение которого в конечном итоге не приводит к появлению устойчивых к нему штаммов. Одним из самых распространенных средств в борьбе со СПИДом являются ингибиторы протеаз - специфические ферменты ВИЧ, необходимые для совершения жизненного цикла данного вируса. Но при их использовании в генах, кодирующих эти ферменты, возникают мутации. В нашем институте создается специальный биочип, способный их обнаруживать, тем самым предсказывая, какие штаммы ВИЧ устойчивы к лекарственному воздействию.

Подчеркнем: задача определения устойчивости к химиопрепаратам обычно возникает тогда, когда диагноз, подтверждающий заражение, уже поставлен и начато лечение. А вот установить сам факт проникновения инфекции бывает довольно сложно. Дело в том, что широко ис-

стр. 36

пользуемые для этого диагностические системы основаны на идентификации в образце, взятом от пациента, специфических антител, вырабатывающихся в организме в ответ на присутствие какой-либо бактерии или вируса. Но метод не всегда эффективен, поскольку при заражении, например, возбудителями гепатита С или СПИДа антитела появляются в крови лишь через месяц или даже год после инфицирования. К тому же небезопасной становится донорская кровь, поскольку не удается своевременно определить ее чистоту. Генетический же анализ выявляет присутствие в ней не антител к вирусу, а его самого - по нуклеиновой кислоте. И тогда снова на помощь приходит биологический микрочип. Он ведь состоит из множества индивидуальных зондов, и в изучаемом образце можно обнаружить несколько различных болезнетворных агентов одновременно. Исходя из этого мы создали биочип для проведения массовых анализов донорской крови на присутствие возбудителей гепатита В и С, различных типов герпеса, СПИДа, сифилиса. Внедрение разработанного метода в деятельность медицинских учреждений позволит эффективней контролировать донорскую кровь, предотвращать заражение пациентов при экстренном переливании.

Наряду с чисто врачебными проблемами существует, как это ни печально, вероятность применения патогенных агентов отнюдь не в мирных целях. Угроза терроризма перешагнула порог нового столетия, и ситуация вряд ли изменится в ближайшие годы. Для эффективной борьбы с последствиями возможного использования биологического оружия необходим мониторинг окружающей среды для обнаружения носителей "снарядов" - особо опасных инфекций. Один из них - сибирская язва B. anthracis. Эта бактерия, относящаяся к роду бацилл, имеет чрезвычайно распространенных, но не опасных "родственников". А "оружие" заболевания - многокомпонентный токсин, отсутствующий у других близких видов. Наиболее важные из его составляющих - летальный фактор и протективный антиген. Поскольку они наследственно закодированы, то, значит, имеют определенные гены, которых нет у схожих бактерий. Наш биочип выявляет, есть ли в исследуемом образце возбудитель сибирской язвы или речь идет о ее родственнице, безопасной бактерии. Причем даже если в качестве биологического оружия будет применен штамм, полученный в результате экспериментальных генно-инженерных работ, то и его присутствие в образце будет "вскрыто" специальным зондом.

Еще большую тревогу вызывает возможность распространения биотеррористами вируса оспы человека - на сегодня как природный источник инфекции он ликвидирован, в живом же виде сохраняется всего в двух лабораториях мира (одна из них в России, другая - в США). И несмотря на все предпринимаемые охранные меры, нельзя исключить случайную или умышленную утечку столь коварного врага. Кроме того, есть определенный риск существования незарегистрированных подпольных его коллекций. Учитывая отмену в 1980 г. вакцинации от данной острозаразной болезни (что привело к отсутствию у человечества иммунитета к ней), она чревата глобальной эпидемией.

Кроме того, "вакантное" место способны занять родственные виды, ранее не представлявшие угрозы. Подтверждение тому - вспышка оспы обезьян среди людей в Африке в 1996 г., вызвавшая множество смертельных случаев. Совокупность указанных факторов говорит о необходимости контроля за возможным распространением носителя. Решение задачи осложняется тем, что по клиническим проявлениям на ранних стадиях оспа человека весьма схожа с другими заболеваниями (ветрянка, герпес) - ими можно заразиться натуральным путем.

Чтобы не бить ложную тревогу, следует искать различия между этими вирусами на генетическом уровне. А поскольку мишеней, которых необходимо достоверно проанализировать, насчитываются десятки, достичь цели позволят только биочипы: в зависимости от того, какой вирус находится в проверяемом образце, соответствующие зонды вступают в реакцию. И изображения, получаемые при этом на экране прибора-анализатора, легко отличимы друг от друга.

Впрочем, обнаружение различных микроорганизмов и выяснение их важнейших характеристик (патогенность, лекарственная устойчивость и др.) далеко не исчерпывают список задач, решаемых с помощью ДНК-биочипов. Они способны определять предрасположенность людей к тому или иному наследственному заболеванию, выявлять его скрытые формы, индивидуальную переносимость химиотерапии и т.д.

Важна также разработка быстрых и тонких методов анализа биологических токсинов, что актуально в пищевой и медицинской промышленности, в области охраны окружающей среды. Ведь наиболее чувствительный иммуноанализ позволяет детектировать 100 пикограммов или менее (10^-12 г) токсина на 1 мл образца. Однако при этом нельзя проводить тест одновременно на наличие нескольких ядовитых веществ. Но решение существует, что доказывают разработанные в нашем институте биочипы с иммобилизованными моноклональными антителами к стафилококковому, сибиреязвенному (летальный фактор), дифтерийному, столбнячному токсинам и рицину (токсичный компонент бобов клещевины, содержится в жмыхе, остающемся при производстве касторового масла).

Созданный на базе нашего института Центр коллективного пользования технологией биочипов помогает специалистам из многих городов страны овладевать соответствующим опытом и более эффективно распоряжаться фундаментальными знаниями, полученными отечественными учеными, для нужд практической медицины.

За цикл работ "Олигонуклеотидные микрочипы для идентификации микроорганизмов, вирусов, анализа их генов и мутаций, ответственных за патогенность и лекарственную устойчивость" С. А. Лапа и Д. А. Грядунов удостоены Государственной премии для молодых ученых в области науки и техники за 2003 г.

Permanent link to this publication: