Libmonster ID: UA-1531

 Автор: Чайлахнян Л. М., Свиридова-Чайлахнян Т. А.

Член-корреспондент РАН Л. М. ЧАЙЛАХЯН, кандидат биологических наук

Т. А. СВИРИДОВА-ЧАЙЛАХЯН, научный сотрудник Института биофизики клетки РАН

На рубеже тысячелетий научная общественность (и не только!) во многих странах, в том числе и в России, взбудоражена активным обсуждением разных сторон проблемы клонирования человека. Вызвано это, несомненно, большими достижениями в последние годы английских, американских и японских исследователей по клонированию лабораторных и, главным образом, сельскохозяйственных животных. Началось все с сенсационной публикации в журнале Nature в 1997 г. о клонировании овечки Долли. Однако этому успеху предшествовали важные методические разработки, осуществленные, в том числе, и в нашей стране еще в середине 80-х годов в Институте биологической физики АН СССР (ныне - Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН).

Реконструкция эмбриональных клеток (под этим в первую очередь понимают замену собственного ядра на какое-либо чужое) позволяет подойти к решению такой важной задачи биологии развития, как выяснение механизмов реализации генетической информации. И здесь, в первую очередь, интересны исследования по анализу тотипотентности * генома клеток разного уровня дифференцировки или его способности к репрограммированию, возможности получения отцовских и материнских копий (т.е. к клонированию), а также получения межвидовых химерных (или мозаичных) животных и т.д. Реконструкция эмбриональных клеток важна и для глобальной проблемы, поднятой впервые также в нашем институте профессором Б. Н. Вепринцевым в 70-е годы, - речь идет о реализации генетической информации криоконсервированных геномов исчезающих видов животных. Впрочем, это далеко не полный перечень того, что связано с использованием различных приемов по реконструкции клеток.

Определенные успехи в области клонирования амфибий, достигнутые в 60-70-е годы, вселяли уверенность в принципиально возможном репрограммировании и других классов позвоночных, при этом особый интерес представляли млекопитающие. Однако выяснилось: пересадка ядер эмбриональных клеток последних технически существенно сложнее, чем первых. Дело в том, что яйцеклетки млекопитающих значительно более чувствительны к микрохирургическим манипуляциям, поскольку их объемные размеры в несколько тысяч раз меньше таковых у амфибий. Для извлечения ядра из зиготы (оплодотворенная яйцеклетка) лягушки или введения его в энуклеированную зиготу неповрежденным необходимо использовать заостренные микропипетки с диаметром кончика не менее 10-20 мкм. А вот для клеток диаметром 70- 80 мкм (зиготы мышей) такой размер пипетки уже является критическим, что, как правило, приводит к их гибели.

Одним словом, перед исследователями, занимающимися пробле-


* Тотипотентность - способность генома, введенного из одной клетки в энуклеированную (лишенную ядра) яйцеклетку того же вида животного, вызывать частичное или полное эмбриональное и постэмбриональное развитие (прим. авт.).

стр. 10


мой клонирования мышей или других млекопитающих, возникла, на первый взгляд, трудноразрешимая задача: как осуществлять трансплантацию ядер без нарушения целостности поверхностной клеточной мембраны.

Впервые эту проблему успешно решили Дж. Мак Грас и Д. Солтер (США), опубликовавшие свои данные в 1983 г. в журнале Sciense, которые, несомненно, стали этапом в разработке концепции клонирования млекопитающих. Они доказали: в определенных экспериментальных условиях (одно из важнейших - присутствие в инкубируемой среде цитохалазина В) можно с помощью микропипетки отсасывать пронуклеусы * из зиготы вместе с частью цитоплазмы и окружающей их поверхностной мембраны, не повреждая ее и формируя тем самым кариопласт ** . Далее мы подробнее остановимся на этом методическом приеме при описании собственных опытов.

Проведенные нами исследования показали: после прокола zona pellucida (прозрачная зародышевая оболочка) микропипетка внедряется "в глубь" клетки, не повреждая ее поверхностную мембрану. Это определяется, главным образом, действием цитохалазина В - он резко увеличивает устойчивость клетки к механическим повреждениям в процессе энуклеации, вызывая деконденсацию микрофиламентов цитоскелета и резко повышая пластичность и адаптивность поверхностной мембраны к различным механическим воздействиям. Кариопласт, как отмечалось выше, формируется за счет всасывания пронуклеусов вместе с цитоплазмой и наружной поверхностной мембраной в микропипетку. После того, как в ней оказывались оба про-нуклеуса, ее осторожно выводили из-под zona pellucida. При этом от оперируемой клетки тянется цитоплазматический тяж, оконча-


* Пронуклеусы - гаплоидные (с одним набором хромосом) материнское и отцовское ядра (прим. авт.).

** Кариопласт - пронуклеусы или диплоидное ядро с прилегающей цитоплазмой, полностью изолированные от внешней среды поверхностной плазматической мембраной (прим. авт.).

стр. 11


тельное истончение которого ведет к образованию как бы двух "клеток" или, точнее, двух изолированных компартментов - цитопласта (лишенная ядра зигота) и кариопласта, т.е. по существу происходит искусственное деление.

Итак, первый этап трансплантации генетического материала из клетки в клетку осуществлен: пронуклеусы из зиготы - без нарушения поверхностной мембраны. Остается второй - введение кариопласта в другую клетку (зиготу), исходно уже энуклеированную.

Попытки инъекцированием ввести кариопласт, образованный пронуклеусами, обратно в зиготу не удавались: первый всегда располагается вне зиготы, но тесно контактирует с ней. Это означало: реконструкция новой клетки (зиготы) из цитопласта (энуклеированная зигота) и кариопласта возможна только при истинном слиянии клеточных мембран, когда вновь формируется единый объем. Для этих целей мы решили применить принципиально новый метод - электрические стимулы (в отличие от Мак Граса и Солтера, которые для слияния кариопласта и энуклеированной зиготы использовали вирус Синдай * ).

К началу наших исследований существовало предположение: слияние двух соседних клеток при подаче на них внешнего электрического поля происходит за счет необратимого электрического пробоя контактирующих мембран. Значит, оптимальное решение поставленной нами задачи было связано с поиском таких способов приложения электричества, когда максимум падения напряжения приходится на мембраны в области контакта. Мы опробовали несколько вариантов.

Во-первых, ток пропускали между большим наружным вольфрамовым электродом и вольфрамовой нитью, введенной в микропипетку. Импульс подавали в момент, когда кариопласт, вводимый под zona pellucida, вступал в контакт с энуклеированной зиготой. Однако во всем диапазоне используемых токов искомое не получалось, ибо внутри микропипетки возникали достаточно сильные электрофоретические смещения среды, что разрушало кариопласт.

Затем мы решили: один из вольфрамовых микроэлектродов будет иметь свободный от изоляции торец кончика диаметром 2-3 мкм, а другой останется таким же, как и в предыдущем случае. Первый подводили в область контакта, после чего пропускали импульсы тока. При этом наблюдали единичные случаи слияния кариопласта с энуклеированной зиготой, однако стоило удалить электрод из области контакта, как либо кариопласт, либо цитопласт разрушались (вероятно, за счет высокой плотности тока вблизи кончика микроэлектрода происходил локальный нагрев и прилипание его к поверхности этих образований).

В третьем варианте сделали так, что электроды и расстояние между ними в несколько раз превышали размеры клетки. В этом случае, чаще всего вскоре после слияния, наблюдали гибель реконструированной зиготы (очевидно, необратимый пробой мембраны происходил не только в области контакта кариопласта с энуклеированной зиготой).


* Вирус Синдай - хорошо изученный патогенный вирус, который, внедряясь в близколежащие друг к другу мембраны соседних клеток, вызывает их слияние (прим. авт.).

стр. 12


Наиболее удачным оказался эксперимент с электродами, у одного из которых диаметр торца был 70-100, у второго - 20-30 мкм, что примерно соответствовало размерам энуклеированной зиготы и кариопласта. Причем электроды - за исключением торцов - были тщательно изолированы. Доля удачных слияний при этом составляла 75-90%.

Сам процесс происходил следующим образом: прооперированную зиготу с введенным под zona pellucida кариопластом помещали вплотную между двумя электродами, причем плоскость контакта ци-топласта и кариопласта была перпендикулярна прямой, соединяющей кончики электродов. Затем каждую клеточную пару отдельно подвергали действию электрических стимулов при напряжении на выходе стимулятора (ЭСЛ-2) 20 В, длительности импульсов 0,1 мс, расстоянии между электродами около 100 мкм.

Сразу же после электрического стимула наблюдается увеличение площади контакта между кариопластом и цитопластом. В дальнейшем контактирующие между собой мембраны постепенно размываются или растворяются. Время между электрическим стимулом и визуально наблюдаемыми признаками начала процесса слияния варьирует от 1-15 с до 20-30 мин, т.е. на три порядка. Но основное количество клеток соединяется в течение 1-10 мин. К оставшимся дополнительно прилагали серию импульсов (два-три с интервалом в несколько секунд), что заметно увеличивало процент слияния.

Для проверки жизнеспособности зигот мышей, реконструированных электрослиянием, их трансплантировали приемным самкам, у которых в положенные сроки появлялись детеныши. Заметим: в дальнейшем по росту и поведению они не отличались от обычного потомства матерей- реципиентов. Было показано: применяемые для слияния электрические импульсы не вносят каких-либо заметных нарушений в геном реконструированной зиготы и могут быть использованы в широком спектре задач по клеточной инженерии.

И еще. Предложенный нами метод имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с используемыми ранее. Во-первых, он универсален - ведь специалистам известны типы клеток, которые невозможно соединить с помощью полиэтиленгликоля или вируса Синдай, а вот электростимуляция срабатывает неукоснительно. Во- вторых, этот метод не связан с какими-либо химическими воздействиями и загрязнениями, склонными понижать жизнеспособность клеток. В- третьих, его отличает ряд экспериментальных удобств, в частности, возможность строгой количественной дозировки в широ-

стр. 13


ком диапазоне. Наконец, с помощью данного метода можно направленно или избирательно сливать вполне определенные пары клеток, что, по- видимому, нереально при использовании традиционных приемов.

Принципиальным результатом наших исследований было также получение химерных мышей на основе разработанных приемов сочетания микрохирургии и электростимулируемого слияния клеток.

Химеры млекопитающих используют очень широко как модельную систему для изучения разнообразных аспектов раннего эмбрионального развития и экспрессии генов. Огромный интерес к ним объясняется тем, что они происходят из двух различных клеточных популяций, вклад которых в образующееся животное может быть оценен количественно и качественно с помощью соответствующих генетических маркеров. Ко времени начала наших опытов существовало два способа получения химер: агрегационный - путем объединения эмбриональных клеток, взятых от животных разных линий или даже видов на стадии дробления, и инъекционный - т. е. посредством введения отдельных клеток или их групп одной линии в бластоцисту другой, где они включаются в состав внутренней клеточной массы. Мы прибегли к абсолютно новому способу - замене одного ядра у двухклеточного эмбриона мыши, взятого из другой линии сочетанием микрохирургии и электрослияния.

Для введения ядра-донора в энуклеированный бластомер использовали метод локального направленного электростимулируемого влияния клеток, когда плоскость контакта этих двух образований была перпендикулярна прямой, соединяющей кончики электродов. Удачный результат при этом составлял 80-90%.

Для оценки способности химерных эмбрионов полно развиваться их трансплантировали приемным самкам, и родился один химерный по окраске шерсти мышонок.

Получение химер описанным способом представляет несомненный интерес, ибо в отличие от обычных позволяет проследить развитие и распределение эмбрионального материала за счет однозначной и симметричной по генетическому материалу маркировки бластомеров с самых ранних этапов развития.

Наш оптимистический прогноз о большом будущем метода электростимулируемого слияния клеток в сочетании с микрохирургией в области клеточной инженерии полностью подтвердился. В конце 80-х - начале 90-х годов появились работы в Англии и США по клонированию эмбрионов кроликов, коров и овец именно этим путем. В них в качестве донорских использовали ядра клеток эмбрионов на стадиях 8-64 бластомера.

В середине 90-х годов важная подвижка проблем клонирования произошла в Англии в работах Я. Вильмута и его сотрудников. Впервые был получен клон из пяти овец, где в качестве донорских использовали ядра из культуры эмбриональных клеток линии TNTU, взятых от 9- дневного эмбриона овцы и прошедших in vitro много (до 25) пассажей. Важным моментом этих исследований явилась синхронизация по клеточному циклу между донорским ядром и реципиентной цитоплазмой. А реконструкция зиготы осуществлялась на основе микрохирургии и электростимуляции. Наконец, в

стр. 14


1997 г. в журнале Nature появилась сенсационная статья тех же авторов о клонировании овечки Долли, которая развилась из реконструированной зиготы, полученной на основе микрохирургии и электрослияния, а донорским явилось ядро из клеточной культуры молочной железы 6- летней овцы. Этот выдающийся успех открыл широкие перспективы для биотехнологии, но вместе с тем породил большое число проблем, как часто бывает с новаторскими исследованиями. Сразу же возник вопрос: возможно ли клонирование других видов млекопитающих?

Ответ не заставил себя долго ждать. В следующем, 1998 г. в июльском номере журнала Nature появилась статья, показавшая реальность полного развития мыши из реконструированной зиготы, где донорским служило ядро соматической клетки взрослого животного. Затем в декабре 1998 г. родились четыре, а в феврале 1999-го - два клонированных теленка. Ядра реконструированных зигот для всех были взяты из культивируемых несколько месяцев клеток ушной раковины 17- летнего призового быка. В марте 1999 г. американские ученые клонировали теленка, использовав клетки 21-летнего быка. А в январе 2000 г. было уже объявлено о клонированном теленке второго поколения, т. е. ядро зиготы, из которой развилась эта особь, взяли из клеток уже клонированного быка. Наконец, в марте 2000 г. тем же методом, что была клонирована Долли, в городе Блексбурге (США) произвели пять поросят. Таким образом, можно сказать, что клонирование взрослых животных стало реальностью для многих видов млекопитающих.

Конечно, вопросов осталось еще очень много. Но мы акцентируем внимание на наиболее важных.

Насколько полноценны и жизнеспособны клонированные животные по сравнению с оригиналами? Не несет ли их геном груз событий, имеющих место у оригинала? Эта проблема в настоящее время активно обсуждается в связи с длиной теломерных * участков ДНК и старением. Заметим, овечка Долли прожила менее трех лет, но у нее родилось четыре ягненка. Интересно, как долго они проживут?

Какие клетки взрослых особей оптимальны для использования их ядер при клонировании? Недавний опыт американских ученых показывает: весьма перспективна в этом отношении культура фибробластов ** взрослого животного, так как тогда резко увеличивается эффективность получения трансгенных клонов. Так была получена клонированная овечка Полли с активным человеческим геном.

Как повысить эффективность процедуры клонирования от долей процентов до десятков процентов, чтобы сделать ее достаточно технологичной и эффективной для животноводства? Решение этой задачи требует новых важных находок как в подготовке донорских кариопластов, так и реципиентных цитопластов.

Наконец, каковы перспективы клонирования человека?

Само собой, наиболее животрепещущий - последний вопрос. Однако ответ на него тесно связан с разрешением предыдущих трех. Кроме того, клонирование человека связано не только с перечисленными выше биологическими проблемами, но в значительно большей степени - с социально-этическими. Однако положительное их решение открывает удивительные возможности для людей. Речь идет о многих глобальных медико-биологических задачах, включая и геронтологический аспект. Правда, это может привести к появлению людей с совершенно необычными свойствами и возможностями. Вместе с тем клонирование человека таит в себе большие опасности для него самого. Таким образом, эта проблема - обоюдоострая *** . Однако хотелось бы отметить: приостановить прогресс науки невозможно, особенно в областях, затрагивающих интересы многих людей. Поэтому необходимо направлять усилия не на запрещение исследований по данной проблеме, а на разработку соответствующих законодательных и этических нормативных актов для успешного их осуществления.

В этой связи важно добавить, что кроме репродуктивного клонирования человека (воспроизведения генетической копии взрослого человека), с которым и связаны все социально-этические проблемы, есть совершенно другое направление - это медицинское или терапевтическое клонирование, которое не сталкивается с этими проблемами, но может стать мощным инструментом в борьбе с различными патологиями. В этом случае 10-15-дневные человеческие эмбрионы, выращенные in vitro (в чашке Петри) используются для получения культуры стволовых клеток, которые в свою очередь могут стать незаменимым средством в заместительной клеточной терапии.


* Теломеры - микроскопически фиксируемые специфические структуры на каждом свободном конце хромосомы (прим. авт.).

** Фибробласты - основная клеточная форма соединительной ткани животных и человека (прим. авт.).

*** См. статью "Вызовы современной биологии" в этом номере журнала (прим. ред.).


© elibrary.com.ua

Permanent link to this publication:

https://elibrary.com.ua/m/articles/view/КЛЕТОЧНАЯ-ИНЖЕНЕРИЯ

Similar publications: LUkraine LWorld Y G


Publisher:

Бельбек ТахумовContacts and other materials (articles, photo, files etc)

Author's official page at Libmonster: https://elibrary.com.ua/Scientist

Find other author's materials at: Libmonster (all the World)GoogleYandex

Permanent link for scientific papers (for citations):

КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ // Kiev: Library of Ukraine (ELIBRARY.COM.UA). Updated: 17.06.2014. URL: https://elibrary.com.ua/m/articles/view/КЛЕТОЧНАЯ-ИНЖЕНЕРИЯ (date of access: 24.06.2024).

Comments:



Reviews of professional authors
Order by: 
Per page: 
 
  • There are no comments yet
Related topics
Publisher
Rating
0 votes
Related Articles
Розуміння Жертви Ісуса Христа Розуміння Воскресіння Ісуса Христа Основа Гносеології Основа Антропології Основа Онтології Це перша публікація цієї роботи - ексклюзив для www.elibrary.com.ua ! Контакт: maximshvets100@gmail.com
6 days ago · From Максим Швець
МЕЖДУНАРОДНАЯ ЛИКВИДНОСТЬ ИНДИИ: ПРИНЦИПИАЛЬНЫЙ СДВИГ
8 days ago · From Petro Semidolya
ЮГО-ВОСТОЧНАЯ ЕВРОПА В ПРЕДСТАВЛЕНИИ АРАБСКИХ ГЕОГРАФОВ IX В.
Catalog: География 
11 days ago · From Petro Semidolya
"ТУРЕЦКОЕ ОЗЕРО": ЧЕРНОЕ МОРЕ В XV-XVII ВВ.
Catalog: География 
11 days ago · From Petro Semidolya
АВСТРАЛИЯ ВО ВТОРОЙ ПОЛОВИНЕ XX ВЕКА: В ПОИСКАХ НАЦИОНАЛЬНОЙ И ПОЛИТИЧЕСКОЙ ИДЕНТИЧНОСТИ
12 days ago · From Petro Semidolya
НОРМАТИВНО-ПРАВОВЕ РЕГУЛЮВАННЯ МИТНИХ ВІДНОСИН У ВЕЛИКОМУ КНЯЗІВСТВІ ЛИТОВСЬКОМУ XVI ст.
Catalog: Право 
14 days ago · From Україна Онлайн
СУЧАСНИЙ УКРАЇНСЬКИЙ ҐРАНД-НАРАТИВ: ПІДХОДИ, КОНЦЕПЦІЇ, РЕАЛІЗАЦІЯ
14 days ago · From Україна Онлайн
The majority of theoretical misconceptions and the most significant misunderstandings in modern astronomy, cosmology and physics are caused by a purely mathematical approach and ignoring philosophical comprehension of physical reality and, as a result, by not deep enough understanding of the essence of certain physical phenomena and objects.
17 days ago · From Павло Даныльченко
The cardinal difference between relativistic gravithermodynamics (RGTD) and general relativity (GR) is that in RGTD the extranuclear thermodynamic characteristics of matter are used in the tensor of energy-momentum to describe only its quasi-equilibrium motion.
17 days ago · From Павло Даныльченко
Якщо за лексикою саме балтські мови є найбільш близькими до санскриту, то праслов'янська мова є найбільш близькою як до більш архаїчної сатемної ведичної стародавньоіндійської мови, так і до стародавньокитайської мови, що згідно з дослідженнями Цун-тунг Чанга була індоевропейською мовою.
19 days ago · From Павло Даныльченко

New publications:

Popular with readers:

News from other countries:

ELIBRARY.COM.UA - Digital Library of Ukraine

Create your author's collection of articles, books, author's works, biographies, photographic documents, files. Save forever your author's legacy in digital form. Click here to register as an author.
Library Partners

КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
 

Editorial Contacts
Chat for Authors: UA LIVE: We are in social networks:

About · News · For Advertisers

Digital Library of Ukraine ® All rights reserved.
2009-2024, ELIBRARY.COM.UA is a part of Libmonster, international library network (open map)
Keeping the heritage of Ukraine


LIBMONSTER NETWORK ONE WORLD - ONE LIBRARY

US-Great Britain Sweden Serbia
Russia Belarus Ukraine Kazakhstan Moldova Tajikistan Estonia Russia-2 Belarus-2

Create and store your author's collection at Libmonster: articles, books, studies. Libmonster will spread your heritage all over the world (through a network of affiliates, partner libraries, search engines, social networks). You will be able to share a link to your profile with colleagues, students, readers and other interested parties, in order to acquaint them with your copyright heritage. Once you register, you have more than 100 tools at your disposal to build your own author collection. It's free: it was, it is, and it always will be.

Download app for Android