Кандидат биологических наук Алла КАЛМЫКОВА, заведующая группой исследования геномных повторов эукариот, аспирант Сергей ШПИЗ, Институт молекулярной генетики РАН

Многолетние исследования теломер - концевых участков хромосом - приблизили разгадку таких важнейших вопросов биологии, как механизмы старения нормальной клетки и причины бессмертия опухолевой. Но как поддерживается устойчивость этих структур у высших эукариот, в том числе и человека, пока до конца не ясно.

В этой связи интересно выявить роль механизма РНК-интерференции (избирательного подавления активности генов) в контроле длины теломер у модельного организма - мухи-дрозофилы.

Напомним: хромосомы - это органеллы ядра клетки, содержащие дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), в которой заключена наследственная информация. Отдельные участки двухнитевой ДНК соответствуют определенным генам, расположенным линейно. В процессе деления клетки на матрице родительской молекулы ДНК синтезируется точно такая же дочерняя. Однако некоторые участки хромосом, в том числе их концевые последовательности - теломеры, не содержат структурных генов и тем не менее выполняют важные функции.

Существование теломер показал на мухах в 1932 г. американский генетик Герман Меллер (нобелевский лауреат 1946 г., иностранный член АН СССР с 1933 г.) и несколько позже на кукурузе установила его соотечественница цитогенетик Барбара Мак-Клинток (нобелевский лауреат 1983 г.), но биологическая их роль долгое время оставалась неясной. Наконец, в наши дни, когда расшифрованы последовательности геномов многих организмов, выяснилось: у теломерной ДНК нет структурных генов, т.е. кодирующих клеточные белки. Например, у млекопитающих она формируется из сотен коротких нуклеотидных повторов, переходящих в так называемую субтеломерную область, состоящую из более сложных повторяющихся последовательностей, но тоже не способных к образованию белка. Лишь далее располагаются участки хромосом, содержащие жизненно важные гены.

В чем же биологический смысл поддержания вроде бы "бессмысленной" теломерной ДНК? В 1971 г. наш соотечественник кандидат биологических наук Алексей Оловников* (в то время сотрудник Института эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи АМН СССР) первым сформулировал вопрос об уко-

* См.: Ф. Киселев. Новое в молекулярной диагностике рака. -Наука в России, 2008, N 1 (прим. ред.).

Теломерные элементы выявляются с помощью флуоресцентно-меченых зондов на концах хромосом дрозофилы.

рочении ДНК на концах линейных (не замкнутых в кольцо) хромосом, или "проблему концевой недорепликации". Кстати, у бактерий и некоторых типов вирусов, имеющих кольцевую геномную ДНК, такой "дефект" отсутствует. Он же выдвинул гипотезу о защитной, буферной роли теломерной ДНК.

Поясним: чтобы после деления каждая клетка получила идентичный хромосомный набор, геномная ДНК должна удвоиться. Процесс синтеза копии последней называется репликацией и осуществляется специальным клеточным ферментом - ДНК-полимеразой. Две комплементарные цепи в молекуле наследственности ориентированы в противоположных направлениях, в то время как ДНК-полимераза может передвигаться вдоль матричных цепей лишь в одном - от конца, содержащего гидроксильную группу, к другому концу, имеющему в составе фосфатную группу. Для начала синтеза нужна РНК-затравка; она затем удаляется, а образовавшуюся брешь в только что синтезированной молекуле ДНК застраивает ДНК-полимераза. На конце с гидроксильной группой этого не происходит, и после удаления РНК-затравки концевая последовательность остается невоспроизведенной. Размер бреши невелик - 7 - 10 нуклеотидов, однако через несколько циклов деления клетки потеря могла бы стать более существенной, в итоге приведя к разрушению жизненно важных генов. К счастью, катастрофы не происходит, и геном сохраняет целостность в бесчисленном ряду поколений.

Оловников не только сформулировал проблему концевой недорепликации, но и предположил, какие пути решения могла создать природа. Он предсказал существование фермента, препятствующего деградации концевой ДНК. И спустя 14 лет эту смелую гипотезу подтвердили американские ученые Кэрол Грейдер и Элизабет Блэкбурн: в 1985 г. они обнаружили фермент теломеразу, осуществляющую удлинение концевой ДНК за счет синтеза коротких повторов (6 - 11 нуклеотидов) на матрице РНК. Цепочка из сотен таких повторов и образует теломерную ДНК. Последняя компенсирует потерю части молекулы, приносимой "в жертву" в процессе концевой ее недорепликации, и служит платформой для связывания многочисленных белков.

Итак, теломера - это находящийся на концах линейных хромосом сложнейший комплекс соответствующей ДНК и ассоциированных с ней белков. Функции его, как теперь выясняется, многочисленны. К ним относятся защита конца хромосомы от деградации, определение ее положения внутри ядра, взаимодействие хромосом при делении клетки, а также контролирование длины самой теломеры. Дело в том, что упомянутый выше фермент теломераза в норме активен лишь в половых и стволовых клетках*. Последние дают начало специализированным или дифференцированным соматическим клеткам (в них этот фермент не работает). Укорочение теломерной ДНК служит сигналом для остановки их деления, а, следовательно, именно оно определяет старение на клеточном уровне.

Упрощенно рассматриваемый механизм можно представить так: чем короче последовательность теломерной ДНК, тем меньше ДНК-связывающих белков присоединяются к ней. По достижении критически низкого их количества на теломере соматическая дифференцированная клетка получает сигнал к остановке деления. В то же время опухолевая ее трансформация часто сопровождается повышенной активностью теломеразы. Такая клетка способна к бесконечному числу делений, т.е. бессмертна.

Полагаем, даже из приведенных кратких пояснений понятно, почему исследование регуляции длины теломер - одно из приоритетных в современной молекулярной биологии. Важнейшие данные об их структуре получены при изучении одноклеточных эукариотических организмов - дрожжей и инфузорий (хромосомы эукариот находятся в ядрах в отличие от бактерий - прокариот). Эти сведения важны и потому, что многие компоненты теломерного белкового комплекса - от дрожжей до Homo sapiens - сходны, поскольку эволюционно очень консервативны.

Классическим модельным объектом для молекулярно-генетических исследований, в том числе болезней человека, является плодовая муха-дрозофила. Это обусловлено общностью многих биологических механизмов у эукариот, как бы далеко они не ___

* См.: А. Коноплянников и др. Реалии и перспективы клеточной терапии. - Наука в России, 2008, N 2 (прим. ред.).

Чрезмерное накопление транскриптов теломерного ретротранспозона наблюдается в яичниках дрозофилы с нарушениями работы системы РНК-интерференции. Крупным планом показана развивающаяся яйцеклетка, в цитоплазме которой накопились транскрипты теломерного элемента.

отстояли друг от друга на филогенетической лестнице. Что касается теломер, то их устройство у данного насекомого - яркий пример того, как природа решает одну и ту же проблему разными путями. Если у большинства эукариот синтез коротких последовательностей теломерной ДНК осуществляет теломераза, то у дрозофилы удлинение теломер происходит за счет перемещений специализированных мобильных генетических элементов* на концы хромосом.

В 40-х годах XX в. Барбара Мак-Клинток наблюдала генетические элементы, способные менять положение в геноме кукурузы. В 1970-х годах в лабораториях отечественных биохимиков Георгия Георгиева** и Владимира Гвоздева (впоследствии академиков) были охарактеризованы так называемые мобильные диспергированные гены у дрозофилы, существенно отличные от уже известных к тому времени клеточных генов. Мобильные элементы кодируют всего несколько белков, необходимых для перемещения в геноме. По способу передвижения их делят на две большие группы - транспозоны и ретротранспозоны*** (к последним относятся и теломерные элементы дрозофилы).

РНК теломерного ретротранспозона по неизвестному пока механизму находит в ядре конец хромосомы, служащий "затравкой" для синтеза на ней ДНК. Подобный синтез на матрице РНК осуществляется с помощью фермента ревертазы, кодируемой самим мобильным элементом. Специалисты полагают, что дрозофила утеряла теломеразу в процессе эволюции, в результате чего у нее возник иной способ восполнения укорачивающейся в процессе клеточных делений концевой ДНК. Точно так же без этого фермента обходятся и комары. Существуют организмы и со смешанным способом поддержания теломер, т.е. использующие как теломеразу, так и мобильные элементы (например, тутовый шелкопряд). А вот столь различающиеся по длине эволюционного пути организмы, как дрожжи, инфузория, позвоночные, включая человека, для удлинения теломер применяют только теломеразу. Но как бы ни различались перечисленные механизмы, природа во всех случаях использовала один принцип - синтез ДНК на матрице РНК.

Мобильные элементы - важная составляющая любого генома (у человека на их долю приходится пятая часть) и в то же время наиболее загадочная. По своему происхождению они - паразиты: их внедрение в жизненно важные гены может приводить к летальным мутациям, серьезному нарушению развития и даже возникновению некоторых форм рака. Многие мобильные элементы имеют вирусное происхождение.

Тем не менее они вносят значительный вклад в эволюцию генома-хозяина. Об этом свидетельствует заимствование некоторыми клеточными генами регуляторных участков мобильных элементов. Так, упоминавшееся поддержание теломер дрозофилы с помощью мобильных элементов - уникальный пример выполнения жизненно важной функции паразитическими структурами генома.

В клетке существуют защитные механизмы, снижающие активность мобильных элементов. Важнейший из них - система РНК-интерференции (РНКи): ее принято считать иммунитетом на уровне нуклеиновых кислот. Это открытие было сделано 10 лет назад американскими учеными Крэгом Меллоу и Эндрю Фаером (нобелевские лауреаты за 2006 г.). Сам механизм эволюционно возник как защита от виру-

* Мобильные генетические элементы - фрагменты ДНК, способные к перемещению в геноме клетки или между геномами. Содержат гены ферментов, необходимых для их перемещения (транспозиции). Встраиваясь в различные участки хромосом, изменяют активность генов, вызывают мутации (прим. ред.).

** См.: Г. Георгиев. Ген метастазина. - Наука в СССР, 1991, N 6 (прим. ред.).

*** Ретротранспозоны - мобильные генетические элементы, в отличие от транспозонов перемещающиеся внутри генома путем образования ДНК-копии на РНК-матрице с помощью фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ревертазы) (прим. ред.).

Тестовая генетическая система позволяет детектировать удлинение теломер у дрозофилы.

сов, в жизненном цикле многих из которых, в отличие от хозяйской клетки, образуются друхцепочечные молекулы РНК. Именно появление последних - сигнал к запуску РНКи. Эти двухцепочечные молекулы разрезаются на короткие интерференционные РНК (размером 21 - 23 нуклеотида), а последние в составе белковых комплексов находят в клетке гомологичную им матричную РНК. В результате ферментативной активности белков, связывающих короткие РНК, происходит расщепление и деградация длинных молекул матричной рибонуклеиновой кислоты, кодирующей вирусные белки, что и останавливает распространение вирусной инфекции.

Считается, что механизм РНКи, эволюционно сформировавшись как противовирусная защита генома, затем был адаптирован для его же нужд, в частности, для подавления активности мобильных элементов. Для многих организмов, в том числе дрозофилы, доказана роль РНКи в поддержании стабильности генома путем контроля количества транскриптов и частоты перемещений упомянутых элементов: чем меньше число транскриптов - промежуточного звена в процессе транспозиции, тем реже перемещаются мобильные элементы. Кроме того, появляется все больше сведений о том, что короткие РНК, всегда составляющие комплекс с белками - участниками механизма РНКи, могут узнавать не только матричную РНК, но и гомологичный им участок генома. Указанные белки, в свою очередь, могут связываться с другими белками, способными влиять на работу гена, а именно, снижать его транскрипционную активность и уменьшать количество синтезируемой матричной РНК. Так может осуществляться подавление экспрессии мобильных элементов. Работами академика Гвоздева и его сотрудников (Институт молекулярной генетики РАН) внесен значительный вклад в понимание роли РНКи в регуляции активности мобильных элементов у дрозофилы.

Представители одной из групп мобильных генетических элементов плодовой мухи - теломерные ретротранспозоны - перемещаются исключительно на конец хромосомы и выполняют важнейшую функцию поддержания длины теломер. Тем не менее, как показывают наши исследования, эти "полезные" ретротранспозоны также являются мишенью системы РНКи. Мы изучали мух, у которых работа генов этой системы была нарушена в результате мутаций. У них наблюдается мощное накопление транскриптов теломерных элементов в яйцеклетке, где, собственно, и осуществляется удлинение теломеры. Кроме того, выявлены короткие интерференционные РНК, гомологичные теломерным элементам, что напрямую указывает: их транскрипты подвергаются специфическому нарезанию с участием системы РНКи. Но меняется ли у таких мутантов частота транспозиций теломерных элементов на конце хромосомы? Иными словами, участвует ли система РНКи в контроле длины теломер?

Для ответа на вопрос мы использовали уникальную тестовую генетическую систему, разработанную несколько лет назад в лаборатории академика Павла Георгиева (Институт биологии гена РАН). Она предусматривает наличие в геноме дрозофилы хромосомы с концевой делецией (нехваткой определенного участка хромосомы), достигаемой с помощью радиационного облучения. Делеция локализуется в районе гена yellow (желтый), продукт которого в норме определяет темную окраску тела и щетинок мух. Мутации гена нарушают синтез пигмента, и особи с концевой хромосомной делецией приобретают желтую окраску, так как ген yellow у них не работает. Однако к оборванному концу хромосомы могут присоединяться теломерные ретротранспозоны, что приведет к активации того же гена и появлению темноокрашенных мух. Механизм такой активации до конца не ясен. Вероятно, белковый комплекс, формирующийся на конце хромосомы, так называемый кэп (колпак), препятствует работе гена, а присоединение теломерного элемента "отодвигает" кэп, открывая возможность функционирования гена.

Мы исследовали, как влияют мутации двух генов, кодирующих белки системы РНКи, на частоту появления темноокрашенных мух (она соответствует частоте присоединения к концу хромосомы теломерных ретротранспозонов). Мутации обоих приводили к возрастанию частоты появления темноокрашенных мух почти на два порядка! Молекулярными методами подтверждено: у них действительно произошло присоединение теломерных ретротранспозонов к концу хромосомы. Это позволило сделать важный вывод: система РНКи участвует в негативной регуляции длины теломер у дрозофилы. Потребность в регуляции такого рода обусловлена тем, что за одно поколение хромосома дрозофилы укорачивается на 70 - 75 пар нуклеотидов, а одно присоединение теломерного

Схема негативной регуляции длины теломер у дрозофилы с участием системы РНК-интерференции.

ретротранспозона обеспечивает удлинение приблизительно на 10000 пар. Чрезмерная активность ретротранспозонов сделала бы хромосомы непомерно длинными, что чревато их слиянием и возникновением аномалий при делении клетки. Таким образом, система РНКи подавляет избыточную активность ретротранспозонов, но позволяет сохранить количество транскриптов, служащих пусковым механизмом этой системы, на уровне, достаточном для осуществления относительно редких (не в каждом поколении) актов удлинения хромосом. Отметим: большинство белков теломерного комплекса у организмов, имеющих теломеразу, участвует именно в негативной регуляции длины теломер.

Важнейшую роль в гомеостазе теломер (поддержании их длины и целостности) играют белковые комплексы. Причем, несмотря на абсолютно разную последовательность теломерной ДНК у дрозофилы и человека, многие теломерные белки у столь несхожих организмов одинаковы. Выше упоминалось, что короткие интерференционные РНК способны находить не только молекулы матричной РНК, но и узнавать гомологичный участок генома, привлекать к нему другие белки. В полной мере это может относиться и к функционированию теломер. В связи с таким предположением укажем на роль механизма РНКи в формировании теломерного белкового комплекса, обнаруженную у дрожжей.

Дрожжи - одноклеточный эукариотический организм, его теломеры формируются за счет активности теломеразы. Однако в их хромосомах, как и у других эукариот, имеется (помимо коротких повторов, образуемых теломеразой) еще и так называемая субтеломерная область. Она составлена из обрывков мобильных элементов и некоторых других повторов. Именно эти последовательности распознаются системой РНКи и служат платформой для привлечения теломерных белков у этих одноклеточных. Таким образом, один из важнейших этапов в функционировании теломеры - сборка теломерного белкового комплекса - осуществляется у дрожжей с участием механизма РНКи. Появились данные о роли этой системы и в теломерах инфузории.

Перечисленные примеры в совокупности с нашими исследованиями на дрозофиле говорят о том, что роль РНКи в поддержании теломер может быть универсальна для разных организмов независимо от конкретного способа удлинения. Теломерные области у всех живых существ обогащены повторяющимися последовательностями различной природы, в том числе и мобильными элементами. Именно они и геномные повторы - излюбленная мишень системы РНКи. Влияя на экспрессию этих повторов, она будет вмешиваться в функциональную структуру теломеры. Пока в пользу этого утверждения говорят лишь разрозненные работы, а данных о влиянии системы РНКи на длину теломер у организмов, использующих теломеразу, не получено. Мы предполагаем, что самые интригующие данные будут получены при изучении терминальных (дающих начало половым клеткам) тканей, где у всех живых существ происходит удлинение теломер и активно работает система РНКи. Хочется напомнить: предсказания Алексея Оловникова о существовании теломеразы воспринимались в 1971 г. многими учеными с большим скепсисом, а сейчас определение активности этого фермента - один из эффективных способов ранней диагностики рака, а сама теломераза рассматривается как мишень противораковой терапии.

Публикатор:

Постоянная ссылка для научных работ (для цитирования):

Комментарии: