Автор: В. В. ВЛАСОВ, М. А. ЗЕНКОВА, Е. Л. ЧЕРНОЛОВСКАЯ

Расшифровка геномов инфекционных агентов, а совсем недавно и человека открыла перспективу радикального изменения самих принципов лечения болезней. Направленно воздействовать на их первопричину, подавляя генетические программы соответствующих бактерий, вирусов и регулируя функционирование генов клетки, ответственных за развитие патологических процессов, становится возможным с помощью фрагментов нуклеиновых кислот - олигонуклеотидов, способных избирательно взаимодействовать с заранее выбранными мишенями.

Академик В. В. ВЛАСОВ, директор Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, доктор биологических наук М. А. ЗЕНКОВА, ведущий научный сотрудник, кандидат химических наук Е. Л. ЧЕРНОЛОВСКАЯ, старший научный сотрудник того же института

Новые методы терапии разрабатывают на основе молекулярной биологии и биоорганической химии. Речь идет о создании препаратов, поражающих инфекционный агент, но не приносящих вреда организму человека. Избирательность действия таких лекарств достижима, если снабдить их структурами, умеющими распознавать определенные генетические программы, характерные для болезнетворных агентов. Справиться с такой сложной и ответственной ролью и адресно доставить необходимые вещества способны олигонуклеотиды. Они представляют собой фрагменты одноцепочечной ДНК и обладают способностью образовывать комплексы с комплементарными им участками ДНК. Специфичность (направленность) их действия чрезвычайно высока: 20-звенный олигонуклеотид безошибочно узнает и связывает комплементарную уникальную последовательность в геноме человека, насчитывающем 3 млрд. нуклеотидных пар. Эту способность нуклеиновых кислот уда-

лось использовать при разработке современных методов медицинской диагностики, основанных на применении микрочипов*. Но наиболее интересная область применения олигонуклеотидов и их модифицированных аналогов - разработка геннаправленных биологически активных веществ.

Идею впервые сформулировали в 60-х годах XX в. в Новосибирском научном центре Д. Г. Кнорре (с 1991 г. академик)** и Н. И. Гринева (ныне доктор химических наук). Они показали: под действием олигонуклеотидов возможна регуляция экспрессии генов, т.е. интенсивности работы генов на уровне транскрипции (процесса образования информационной, или, как ее еще называют, матричной РНК), и трансляции (синтеза белка на рибосомах). Получаемые биологически активные

* См.: С. А. Лапа, Д. А. Грядунов. Диагноз ставит... биочип. - Наука в России, 2004, N 6 (прим. ред.).

** См.: Д. Г. Кнорре. Адресат - аппарат наследственности. - Наука в СССР, 1985, N 1 (прим. ред.).

стр. 41

Регуляция экспрессии генов на разных уровнях с помощью препаратов на основе олигонуклеотидов.

Механизм действия антисмысловых олигонуклеотидов. А - при связывании дезоксирибоолигонуклеотидов с РНК она расщепляется под действием РНКазы Н; В - связывание олигонуклеотидов с мРНК препятствует ее взаимодействию с рибосомой и блокирует синтез соответствующего белка.

вещества воздействуют на различные генетические структуры, приводя к их временному "выключению" или же запуская процессы изменения программ - мутации. В настоящее время работы в этом направлении ведут во многих развитых странах.

АНТИСМЫСЛОВЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ

Свое название получили благодаря связыванию с мРНК, представляющими собой РНК-копии кодирующей, или смысловой цепи ДНК. Это были первые препараты геннаправленного действия и предназначались они для избирательного подавления вирусных и определенных клеточных РНК. В соответствии с исходными идеями Кнорре и Гриневой предполагалось: антисмысловые олигонуклеотиды, снабженные химическими реакционноспособными группами, будут связываться

стр. 42

с целевыми нуклеиновыми кислотами и избирательно их химически модифицировать, подавляя функционирование.

Дальнейшие исследования показали: само по себе такое связывание с РНК оказывает существенное воздействие на их функции и даже может приводить к разрушению РНК-мишени ферментами клетки. Например, связывание олигонуклеотидов с участками мРНК, ответственными за инициацию трансляции, подавляет функционирование мРНК. Некоторые химически модифицированные аналоги олигонуклеотидов способны к образованию таких прочных комплексов, что они, связываясь с любым участком мРНК, блокируют продвижение по ним рибосом и останавливают синтез соответствующего белка. Был обнаружен также особый клеточный фермент, РНКаза Н, который разрушает РНК там, где с ней связаны антисмысловые олигонуклеотиды, построенные из дезоксинуклеотидов. За счет этого эффекта введение последних в клетки приводит к разрушению РНК, с которыми они взаимодействуют.

Впрочем, активировать РНКазу Н способны не все олигонуклеотидные аналоги, и специалисты пытаются сконструировать такие, что действовали бы независимо от клеточных ферментов. Один из подходов к решению проблемы - использование каталитических групп, имитирующих активные центры ферментов рибонуклеаз, разрушающих РНК. В настоящее время разработан широкий спектр модифицированных олигонуклеотидов, несущих различные химические группы, способные ковалентно присоединяться к нуклеиновым кислотам или вносить в них повреждения и инактивировать их. Новые перспективы появились в связи с открытием каталитических РНК (рибозимов) и ДНК (ДНКзимов), расщепляющих рибонуклеиновые кислоты. Уже известно несколько компактных структур данного типа.

Антисмысловые олигонуклеотиды, а также каталитические РНК и ДНК широко применяют в биологических исследованиях и на их основе создают терапевтические препараты, действующие на вирус- и опухолеспецифические РНК.

ИНТЕРФЕРИРУЮЩИЕ РНК

В последние годы обнаружен мощный механизм подавления экспрессии генов под действием двухцепочечных РНК (дцРНК), соответствующих по последовательности матричным РНК. При попадании в клетку дцРНК происходит их расщепление на короткие фрагменты длиной от 19 до 21 пар оснований, которые при участии специфических ферментов взаимодействуют с РНК, если в ней есть последовательность, комплементарная одной из цепей фрагментов. Образование комплекса сопровождается ферментативным разрушением РНК и ингибированием экспрессии, т.е. подавлением активности определенных генов. Такой процесс эффективно протекает в клетках беспозвоночных и в растениях. А у млекопитающих под действием длинных дцРНК происходит индукция синтеза интерферонов, отвечающих за неспецифическую защиту клетки от РНК-содержащих вирусов. Поэтому для воздействия на клетки млекопитающих длинные дцРНК неприменимы. Однако если использовать не протяженные, а короткие, так называемые малые интерферирующие РНК, или siРНК, то индукция синтеза интерферонов отсутствует, что позволяет избирательно подавлять экспрессию генов.

Двухцепочечные РНК проявляют активность в чрезвычайно низких концентрациях, а длительность эффекта достигает нескольких суток. Синтезировать их можно химически или вводя в клетки генетические конструкции, постоянно продуцирующие дцРНК и заставляющие замолчать целевой ген навсегда. Препараты на этой основе практически нетоксичны и уже испытаны в опытах на животных; с их помощью удается подавить размножение самых различных вирусов и резко снизить продукцию определенных клеточных белков.

АНТИГЕННЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ

С помощью олигонуклеотидов можно избирательно воздействовать на экспрессию генов на стадии транскрипции. В ряде случаев эту задачу решают, используя свойства некоторых особых последовательностей ДНК, в которых одна из цепочек содержит только пуриновые нуклеотиды, а другая - пиримидиновые. С такими участками могут связываться соответствующие им по последовательности олигонуклеотиды, тоже состоящие из пуриновых или пиримидиновых нуклеотидов. Формирующиеся при этом трехцепочечные структуры препятствуют взаимодействию белков с соответствующими участками ДНК и функционированию конкретных генов. Однако возможности данного подхода ограничены, поскольку необходимые пуринпиримидиновые участки встречаются в ДНК нечасто.

Недавно были синтезированы олигонуклеотидные аналоги, образующие с ДНК комплексы повышенной прочности и способные внедряться в ее структуру, расплетая двойную спираль. Наиболее известные из них - полиамидные нуклеиновые кислоты PNA и так называемые "фиксированные" - LNA. В первых рибозофосфатный остов, имеющийся в природных нуклеиновых кислотах, заменен на полиамидную цепочку, не имеющую отрицательного заряда. Это устраняет один из факторов, дестабилизирующих комплементарные комплексы, - электростатическое отталкивание цепочек. Что касается вторых, то структура нуклеотидного сахарного остатка в них жестко зафиксирована в конформации, благоприятной для формирования комплекса антигенных олигонуклеотидов с цепочкой ДНК. Образование комплекса олигонуклеотида с ДНК, сопровождающееся расплетением ее двойной спирали, препятствует связыванию с ДНК факторов транскрипции и приводит к временному "выключению" соответствующих генов.

СРЕДСТВА ГЕМОТЕРАПИИ

Внимание специалистов уже давно привлекают методы мутагенного воздействия на ДНК олигонуклеотидами или их производными. В случае успеха станет реальным необратимо подавлять функционирование конкретных генов, например,

стр. 43

На стадии транскрипции экспрессия гена подавляется синтетическими аналогами олигонуклеотидов, прочно связывающимися с ДНК и способными вытеснять одну из ее цепей. Наиболее известные из таких аналогов PNA (А) и LNA (В) блокируют взаимодействие с ДНК специфических белковых факторов (TF) и подавляют функционирование соответствующих генов (С).

Исправление точечных мутаций с помощью олигонуклеотидов. При связывании мутагенных олигонуклеотидов (показаны красным цветом) с одной из цепей ДНК формируется комплекс с некомплементарной парой нуклеотидов. Ферменты репарации заменяют эту пару, чтобы восстановить комплементарное взаимодействие.Таким образом часть репарированных молекул ДНК приобретает нормальную, исправленную последовательность.

ДНК-вирусов или генов, ответственных за злокачественное перерождение клеток. В принципе достижимо внесение мутации в любые заданные нуклеотидные последовательности, а значит, и коррекция дефектных генетических программ.

Недавно наши исследователи выявили, что осуществимо внесение точечных мутаций с помощью короткого олигонуклеотида, содержащего однонуклеотидную замену. Комплексообразование его с ДНК приводит к мобилизации ферментов системы репарации, манипулирующих с некомплементарной нуклеотидной парой как с повреждением и заменяющих нуклеотид в одной из цепей на комплементарный. В ходе этих процессов может происходить исправление целевой последовательности ДНК. Хотя, как установлено, эффективность описанного подхода и невелика, тем не менее он может быть перспективным применительно к стволовым клеткам*: после обработки мутагеном их можно размножить и затем ввести в организм (генотерапия ex vivo).

Словом, опыт последних лет подтвердил плодотворность идеи использования олигонуклеотидов в качестве базовых структур для создания геннаправленных биологически активных веществ. Ряд подобных средств терапии вирусных и воспалительных заболеваний проходит клинические испытания. Очевидно, за перечисленными технологиями большое будущее, поскольку соответствующий специфический препарат для защиты от поражения любым вирусом можно быстро разработать и производить по универсальной технологии. Это облегчит создание средств борьбы с новыми инфекциями и для защиты от биологического оружия.

Быстро развивающиеся исследования по подавлению экспрессии генов двухцепочечными РНК, изучение направленного мутагенеза позволяют рассчитывать на появление в скором времени эффективных лекарств от заболеваний, пока не поддающихся существующим методам лечения.

* См.: В. Н. Ярыгин и др. Всемогущие клетки. - Наука в России, 2004, N 1 (прим. ред.).

Постоянный адрес данной публикации: