Доктор биологических наук В.В. РОЩИНА, ведущий научный сотрудник Института биофизики клетки РАН, кандидат биологических наук Е.В. МЕЛЬНИКОВА, старший научный сотрудник того же института, кандидат биологических наук В.Н. КАРНАУХОВ, заведующий лабораторией микроспектрального анализа и клеточного мониторинга окружающей среды, заместитель директора того же института.

Фотолюминисценция (свечение после поглощения света) используется для исследования в различных сферах деятельности человека. В биологических системах чаще анализируют данное явление малой продолжительности (менее 10 -6 с), называемое флуоресценцией, в отличие от более длительной - фосфоресценции. Первое у живых клеток наблюдается в видимой области спектра (400-750 нм) под люминесцентным микроскопом при действии ультрафиолетового света. Клетки микробов и грибов светятся сине-зеленым светом, а клетки животных слабо - в голубой области спектра (при повреждении - и в зелено-желтой). Множество клеток растений могут флуоресцировать во всем диапазоне видимого спектра. Причем по сравнению с клетками животных они делают это интенсивнее, и, благодаря исключительному богатству пигментов, демонстрируют больше вариаций по цвету испускаемого свечения. Так, ярко-красная флуоресценция зеленых фотосинтезирующих клеток обусловлена присутствием пигментов хлорофилла. Бесхлорофилльные клетки зрелой пыльцы и секреторные клетки (волоски, железки) светятся преимущественно голубым или желто-зеленым светом, что связано с наличием в них фенолов, терпенов и других соединений.

Исследования, проведенные в нашей лаборатории, показали: флуоресценция неповрежденных клеток растений позволяет диагностировать их с разным химическим составом, оценивать изменения оболочек и содержимого клеток в процессе развития и под действием неблагоприятных факторов. Открылись новые перспективы прижизненной биохимии клеток, изменения в метаболизме которых до этого анализировали только с помощью методик, приводящих к разрушению структуры изучаемых объектов. Помимо визуального наблюдения флуоресценции в люминесцентный микроскоп был применен и микроспектрофлуориметр, созданный В. Н. Карнауховым с сотрудниками для регистрации спектров флуоресценции. Оригинальная разработка этого прибора запатентована в 80-е годы во многих странах. С его помощью регистрируют спектры флуоресценции отдельных клеток растений, животных и микроорганизмов и даже их стенок. В зависимости от специализации растительной клетки, фазы ее развития и влияния внешних факторов в этих спектрах появлялись и исчезали пики (максимумы), отражающие превращения определенных веществ.

Что же удалось установить? Какие открылись возможности и какие проблемы встали перед исследователями? Прежде всего нами было показано, что наиболее ценную информацию дает анализ секреторных клеток волосков и железок растений. В обычный микроскоп они плохо различимы на фоне основной массы бесцветных, зеленых или желтовато-темных тканей. Иное дело, когда растительную поверхность облучают ультрафиолетовым светом под люминесцентным микроскопом. В. В. Рощина и Е. В. Мельникова провели микроспектрофлуориметрический анализ неповрежденных секреторных клеток более 50 видов растений, содержащих разнообразные светящиеся продукты метаболизма - фенолы и терпеноиды, алкалоиды и полиацетилены. Они резко выделялись среди несветящихся или имеющих другой цвет свечения участков тканей. Светится также секретирующая поверхность клеток пыльцы (мужского гаметофита).

Еще одним примером служит специфическая ткань плавающего в воде насекомоядного растения - пузырчатки Utricularia. Ее рассеченные листья выглядят как нить с ловушками, покрытыми железками со слизью. Под люминесцентным микроскопом поверхность ловушки светится красным светом за счет зеленого пигмента хлорофилла. На этом фоне хорошо заметны слизесодержащие железки, светящиеся желтым. В спектрах флуоресценции последних (сплошная линия) и выделившегося из них секрета (пунктирная линия) имеется один и тот же максимум (545 нм). В спектрах же флуоресценции несекреторных клеток он отсутствует (точечная линия), а виден максимум 680 нм, относящийся к красному свечению, свойственному хлорофиллу. Желтое свечение слизевых железок обусловлено, по-видимому, присутствием алкалоидов.

Люминесценция разных типов секреторных клеток, как выяснилось, отличается в зависимости от их химического состава. Голубое или сине- зеленое свечение отмечено у терпеноидсодержащих волосков мяты, накапливающих фенолы и алкалоиды клеток окопника, богатых фенолом почек березы. Желтое или оранжевое свечение часто наблюдается у секреторных клеток корней бархатцев, заполненных полиацетиленами и алкалоидами, тогда как основная масса их несекреторных клеток флуоресцирует голубым. Секретирующая поверхность пыльцы (мужского гаметофита) тех же растений в зависимости от химического состава секрета и поверхностных пигментов (фенолов, каротиноидов, азуленов и др.) флуоресцирует в синей, желтой, зеленой и красной областях спектра.

Таким образом, нами показано: у многих растений можно идентифицировать секреторные клетки под люминесцентным микроскопом. Это важно для ботанической практики и изучения состава секретов, поскольку они - источники самых разнообразных биологически активных продуктов, в том числе веществ, привлекающих или отпугивающих насекомых, а также соединений, защищающих от инфекции (не случайно ими богаты так называемые лекарственные растения) и поедания животными.

Флуоресценция пестика (женского гаметофита) и пыльцы тоже дает важную информацию. Прежде всего - об их физиологическом состоянии, способности к нормальному оплодотворению, чувствительности к загрязнителям окружающей среды. В нашей лаборатории было установлено: при прорастании пыльцы на искусственной питательной среде гасится флуоресценция жизнеспособных пыльцевых зерен, а нежизнеспособные, напротив, ярко светятся, и в дальнейшем не прорастают. Это позволяет их различать уже в первые минуты после смачивания водой. Кроме того, флуоресцентный анализ помогает довольно четко отличить пыльцу у неспособных (самонесовместимых) и способных (самосовместимых) к самоопылению растений одного вида. Скажем, у петунии, относящейся к последним, отсутствуют или снижены максимумы спектров, характерных для каротиноидов и азуленов.

Следует также отметить: пыльца растений чувствительна к различным неблагоприятным факторам. Под их влиянием или при длительном хранении разрушаются многие пигменты на ее поверхности; это обычно сопровождается потерей жизнеспособности, что быстро устанавливает и флуоресцентный анализ. Например, под влиянием высоких концентраций озона и перекиси водорода, облучения ультрафиолетовым светом разрушаются каротиноиды и исчезает свойственная им флуоресценция в желто-оранжевой области спектра. Таким образом, разработанные нами методики микроспектрального анализа дают возможность без длительного выращивания растений и биохимического контроля определить жизнеспособность пыльцы и ее готовность к оплодотворению, что очень важно для практической работы генетиков и селекционеров.

Однако не только практическая значимость феномена флуоресценции пыльцы и пестика привлекает исследователей. Поразительно, но на поверхности пестика она характеризует ее способность распознавать пыльцу своего или чужого вида. В 1994 г. мы получили первые соответствующие спектры, когда при использовании целого растения в течение нескольких секунд сразу после контакта пестика и пыльцы в них появлялись новые максимумы и исчезали старые. Важно отметить, это происходило только в ответ на соприкосновение клеток собственного вида, а не чужого. Несмотря на манипуляции под люминесцентным микроскопом, пыльца, попавшая на пестик своего вида, нормально прорастала, происходило оплодотворение, формировался зародыш и в дальнейшем образовывались плоды и жизнеспособные семена.

Впрочем, возможности анализа флуоресценции растительных клеток далеко не изучены. И последующие исследования наверняка приведут к новым открытиям в мире живых организмов.